МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА БАКТЕРИЙ
Введение.Бактерии относятся к доминиону Bacteria. Они являются одноклеточными прокариотическими (доядерными) организмами. Бактериальная клетка обладает характерными
особенностями строения (ультраструктуры) и существенно отличается от эукариотической.
Бактерии имеют микроскопические размеры, большинство — в пределах разрешающей способности светооптической микроскопии (превышают 0,2 мкм), однако существуют и более мелкие формы.
Форма клетки относится к числу важных таксономических признаков бактерии. По форме клеток бактерии подразделяют на шаровидные, палочковидные, нитевидные и извитые (рис. 2.1).
Шаровидные бактерии — кокки (coccus — зерно) имеют правильную сферическую или эллипсоидную форму. Кокки могут образовывать характерные скопления, что обусловлено особенностями их деления и способностью дочерних клеток сохранять связь друг с другом после деления. Кокки могут располагаться беспорядочно (микрококки), парами (диплококки), в виде цепочек из 3 и более кокков (стрептококки), в виде пакетов, состоящих из 4 (тетракокки) и 8 (сарцины) кокков, и в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь (стафилококки).
Диплококки и стрептококки образуются при делении в одной плоскости, если дочерние клетки могут не отходить друг от друга. Упорядоченное деление в 2 и 3 плоскостях приводит к образованию тетракокков и сарцин. При делении в разных плоскостях образуются стафилококки.
Палочковидные бактерии (бациллы) различаются по размерам, форме клеток и их концов, а также по расположению. Они могут быть тонкими, утолщенными на концах либо с обрубленными концами. Одни располагаются в виде одиночных клеток, другие парами — диплобактерии, третьи в виде цепочек — стрептобактерии.
Извитые формы бактерий представлены изогнутыми палочками, имеющими V4- У2 завитка (вибрионы) или несколько (1—3) завитков (спириллы), и спиралевидными бактериями (спирохеты). Нитевидные и ветвистые формы характерны для актиномицетов.
Бактерии не имеют дифференцированного ядра. Нуклеоид бактерий — аналог ядра — не окружен мембраной и располагается в цитоплазме. Бактерии лишены внутриклеточных мембран и ограниченных ими органелл. Плазматическая мембрана (ПМ) является единственной мембраной, присущей всем бактериальным клеткам. В цитоплазме бактерий свободно располагаются рибосомы, могут также присутствовать включения и споры (рис. 2.2). Последние могут располагаться терминально, субтерминально и центрально. Снаружи от ПМ находится клеточная стенка (КС). По строению КС бактерии подразделяют на 2 группы: фирмикутные и грациликутные. КС может быть покрыта капсулой или капсулоподобной оболоч-
![]() |
Рис.2.1. Формы бактерий. Рис.2.2. Споры бактерий,
а — шаровидные; б — палочковид- а — терминальное расположение; б —
ные; в — извитые. субтерминальное; в — центральное.
кой. Многие бактерии имеют внешние органеллы движения — жгутики (рис. 2.3). Реснички (фимбрии, пили), располагающиеся на поверхности клетки, участвуют в прикреплении бактерий к различным субстратам (адгезии) и друг к другу (коге-зии).
Для изучения морфологии и ультраструктуры бактерий применяют световую и электронную микроскопию.
Морфологию бактерий обычно изучают методом световой микроскопии фиксированных окрашенных препаратов. Для окрашивания бактерий применяют различные красители. Чаще
![]() |
всего используют анилиновые
красители (метиленовый си
ний, генциановый фиолето
вый, малахитовый зеленый,
фуксин и др.). В основе ок
раски лежат сложные хими
ческие и физико-химические
реакции между красителем и
химическими соединениями в
составе бактериальной клетки.
При этом различные струк
турные компоненты клетки
могут окрашиваться разными
красителями. Цитоплазма
(особенно в фиксированных
мазках) обладает сродством к
Рис.2.3. Жгутиковые бактерии. основным красителям (мети-
а — монотрих; б - лофотрих; в - леновый СИНИЙ, кристалли-
амфитрих; г — перитрих. ческий фиолетовый, везувин
и др.). Для выявления различных структур бактериальной клетки применяют нейтральные и кислые красители.
Различают простые и сложные методы окраски. Простые методы заключаются в окраске препарата одним красителем и позволяют изучать форму и размеры бактерий. Сложные методы (по Граму, Цилю—Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Тинкториальные свойства — способность воспринимать и удерживать красители — зависят от особенностей строения и химического состава бактериальной клетки. Сложные методы окраски позволяют дифференцировать бактерии по этим признакам и имеют диагностическое значение. Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактерий: жгутиков, капсул и разных цитоплазматичес-ких включений.
Методы темнопольной и фазово-контрастной микроскопии дают возможность прижизненного изучения бактерий, в частности их подвижности. Для этого готовят нативные (прижизненные) препараты.
Электронную микроскопию используют для изучения ультраструктуры (тонкой организации) бактерий.
Тема 2.1. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ И ИХ ТИНКТОРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ
▲ План
▲ Программа
1. Морфология бактерий и методы ее изучения.
2. Подвижность бактерий и методы ее изучения.
3. Простые методы окраски препаратов.
4. Определение размеров бактерий.
а Демонстрация
1. Приготовление мазков из бактериальных культур.
2. Красители, используемые в микробиологии.
3. Подвижность бактерий в препарате "висячая" капля.
▲ Задание студентам
1. Микроскопировать и зарисовать готовые мазки, окрашенные простым методом (стафилококки, стрептококки, сарцины, палочки, стрептобациллы).
2. Приготовить мазки из бактерий, выращенных на жидкой и плотной питательных средах.
3. Окрасить мазки простым методом.
4. Микроскопировать и дифференцировать бактерии в
мазках по основным морфологическим признакам и зарисовать их. 5. Определить размеры бактериальной клетки.
Методические указания
Приготовление препаратов для микроскопического исследования.Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях используют препаровальные иглы.
Петлю прокаливают в пламени горелки для уничтожения посторонних бактерий. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ееV и IV пальцами к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю впробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движением захватывают материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают край пробирки и закрывают пробкой. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой.
Приготовление нативньгх препаратов для прижизненного изучения микроорганизмов.Метод "висячей" капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю исследуемого материала. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют объектив малого увеличения (8х или 10х), находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х или иммерсионный и исследуют препарат. Определяют подвижность бактерий.
Метод "раздавленной" к а п л и. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла.
Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001 % раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат "висячая" или "раздавленная" капля и микроскопируют.
После микроскопии препараты "раздавленной" или "висячей" капли опускают в дезинфицирующий раствор.
Приготовление фиксированных препаратов-мазков.Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят суспензию (взвесь) бактерий. Если мазок готовят из
жидкой питательной среды, то материал непосредственно наносят петлей на предметное стекло и распределяют его так, чтобы получить тонкий мазок. В других случаях первоначально на предметное стекло наносят каплю, воды, или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и готовят взвесь. При правильном распределении материала в мазке при микроскопии видны изолированные бактериальные клетки. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать.
Фиксация препарата. Высушенные мазки подвергают термической или химической обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло проводят несколько раз через пламя горелки (мазком вверх).
Мазки крови, мазки-отпечатки из органов фиксируют погружением на 5—20 мин в метиловый или этиловый спирт или другие фиксирующие жидкости.
Окраска препаратов простым методом.Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.
Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии.Для люминесцентной микроскопии на предметных стеклах готовят фиксированные препараты-мазки или на-тивные препараты, которые окрашивают специальными флюоресцентными красителями: акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином, корифосфином. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.
Приготовление препаратов для электронной микроскопии.Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницаемо для электронов. Исследуемый объект максимально очищают от посторонних примесей и наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую сеточку. Для контрастирования применяют соединения тяжелых металлов (золото, осмий, рутений и др.).
Измерение микробных клеток.Измерение микробов осуществляют в ходе микроскопического исследования с помощью специальных приспособлений. Для измерения применяют окуляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр служит для непосредственного измерения объекта и представляет собой стеклянную пластинку в окуляре, в центральной части которой нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр представляет собой стекло, в середине которого имеется эталонная шкала, разделенная на 100 частей. Цена деления шкалы
известна и указана на стекле. Обычно каждое деление шкалы объект-микрометра равно 10 мкм.
Микроорганизмы измеряют окуляр-микрометром, предварительно определив цену его делений с помощью объект-микрометра. Для этого объект-микрометр устанавливают на предметном столике микроскопа и, вращая винтами для перемещения столика, добиваются, чтобы одно из его делений совпало с каким-либо делением окуляр-микрометра. Затем отмечают число делений объект-микрометра, в которые полностью укладывается число делений окуляр-микрометра. Зная величину деления объект-микрометра (10 мкм), устанавливают величину деления окуляр-микрометра. После этого объект-микрометр заменяют исследуемым препаратом и определяют размеры бактериальной клетки линейкой окуляр-микрометра при той же степени увеличения, при которой была измерена величина его делений.
Для измерения микроскопических объектов используют следующие метрические единицы: 1 микрометр (мкм) = Ю-3 мм, 1 нанометр (нм) = 10~° мм.
Результаты изучения бактериальной культуры протоколируют, как показано в табл. 2.1.1.
Таблица 2.1.1. Характеристика культуры по морфологическим и тинк-ториальным признакам (форма протокола)
Форма | Размеры | Окраска по методу Грама | Наличие | Кислото- устоичи- вость | Под- |
клеток | спор | капсул | зерен волю-тина |