Генетика бактерий
Изменчивость бактерий обусловлена достаточно многочисленными процессами рекомбинаций и мутаций хромосом, а также за счет плазмид, транспозонов, Is-частиц и умеренных фагов. Изменчивость бактерий может быть наследуемой и приводить к появлению новых или исчезновению некоторых свойств бактерий. Мутации условно поделены на естественные и индуцированные, наводимые с помощью мутагенов
Индукция мутаций под воздействием ультрафиолетового облучения
В качестве источника УФ0 используют бактерицидную лампу ВУФ-15, устанавливают ее на расстоянии 60 см от центра облучения объекта. Облучение желательно проводить при красном цвете или в темноте.
Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, на основе которой устанавливают оптимальную мутационную дозу, равную 0,1-1,0 % от числа выживших бактерий.
Для получения lac-мутантов E.coli испытуемую культуру предварительно выращивают в питательном бульоне в течение 14-18 ч. Концентрация бактериальных клеток должна быть 2х108 в 1 мл. Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 м раствора MgSO4 и охлаждают на льду для прекращения деления клеток. Суспензию в объеме 40 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15 мин при 150 С. После этого клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в питательном бульоне и делают несколько разведений.. Пробирки с питательным бульоном инкубируют при 370 С в течение 14-18 ч. Затем из разведений 10-2-10-5 по 0,1 мл высевают на плотную элективную питательную среду (в данном случае - Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.
Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика (ампициллин 10 мг на 1 мл, левомицетин 5 мг на 1мл).
На среде Эндо lac-мутанты E.coli образуют бесцветные колонии. Клетки E.coli, которые выросли на среде с указанной концентрацией антибиотиков, являются резистентными к нему. Параллельно делают контрольные посевы этой же культуры без облучения.
Постановка опыта трансформации. Реципиент - Bacillus subtilis StrS (чувствитльный к стрептомицину). Донор - ДНК, выделенная из штамма Bacillus subtilis StrR (устойчивый к стрептомицину). Среда - питательный агар, содержащий 100 ED в 1 мл стрептомицина.
В пробирки к 1 мл бульонной реципиентной культуры B.subtilis добавляют ДНК донора (1 мкг на 1 мл) для их инкубации при 370 С в течение 30 мин. Далее в пробирки вносят 0,1 мг на мл раствора ДНКазы в 0,5 мл хлорида магния (для разрушения свободного ДНК) и выдерживают 5 мин. Для определения количества стрептомицин устойчивых бактерий, 0,1 мл неразведенной смеси засевают на питательную среду на чашки Петри. Для определения клеток реципиентной культуры из смеси готовят 10-ти кратные разведения в 0,85 % растворе хлорида натрия до 10-5-10-6 (для получения сосчитываемого количества колоний) и высевают по 0,1 мл на питательную среду без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти. Посевы инкубируют при 370 С. На следующий день учитывают результаты. Определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных колоний к числу колоний реципиентного штамма.
Постановка опыта по специфической трансдукции. Реципиент - штамм E.coli lac-, не имеющий В-галактозидазного оперона, контролирующего лактозу. Трансдуцирующий фаг - фаг dgal, в геноме которого часть генов замещена В-галактозидазным опероном E.coli. Он является дефектным, неспособным вызывать лизис кишечной палочки и обозначается как d(фаг dgal) с названием содержащегося в геноме бактериального оперона gal. Элективная среда - Эндо.
К 1 мл 1 ч бульонной культуры реципиентного штамма вносят 1 мл трансдуцирующего фага в концентрации 10-6-10-7 частиц в 1мл. Смесь инкубируют при 370 С в течение 60 мин, а затем готовят ряд десятикратных разведений культуры. Из пробирки с разведением культуры 10-6 делают высев по 0,1 мл на три чашки Петри со средой Эндо. Посевы инкубируют сутки, затем учитывают результат и вычисляют величину трансформации. Например, после посева 0,1 мл культуры в разведении 10-6 на трех чашках, где выросло соответственно, 138, 170, 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, а на 1 и третьей чашках выросли колонии красного цвета, следовательно, частота трансдукции:
(5+1)х10х106х (138+170+160):10х106 = 6 :468 = 1.10-2
Постановка опыта конъюгации с передачей R-плазмиды. Плазмида контролирует множественную устойчивость к антибиотикам: Str, Tcn, Cmc (стрептомицин, тетрациклин, хлорамфеникол). Донор - штамм E.coli K12 R+leu-StrRТcnRCmcR. Реципиент штамм E.coli K12 R-leu-StrSTcnSCmcS. Cреда минимальная глюкозо-солевая, содержащая эти антибиотики в концентрации 50 мкг в 1мл каждый.
В стерильную пробирку вносят по 1 мл 3-х ч бульонной культуры реципиента и донора. Смесь инкубируют при 370 С в течение 2 ч и высевают в объеме 0,1 мл в чашки с элективной средой, где вырастают резистентные штаммы. Отсутствие роста донора можно объяснить потребностью в лейцине, а роста реципиента - в чувствительности к антибиотикам. Частоту образования трансконъюгантов определяют отношением их к числу реципиентных клеток. Например, при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10-4 на глюкозо-солевую среду с лейцином получено 20 колоний, а при высеве смеси - 60 колоний трансконъюгантов. Частота формирования трансконъюгантов:
(60х10) : (20 х 10х104) = 60х102 : 2х106 = 3,0.10-4
Определение колициногенных факторов (col-плазмида). Исследуемые культуры E.coli засевают методом укола в питательную среду в чашки Петри (7-8 уколов в чашке). Посевы инкубируют при 370 С в течение суток. после чего на внутреннюю поверхность чашек Петри помещают кусочки ваты, смоченные хлороформом, в парах которого погибают бактерии.
По поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного агара, который смешан с 0,2 мл часовой бульонной индикаторной культуры (чувствительной к данному колицину E.coli). Через 18-20 ч инкубации культуры появляются результаты опыта. Среди посевов индикаторной культуры появляются прозрачные зоны, соответствующие посевам исследуемой культуры.
Определение колицинотипа. В питательный агар в чашках Петри методом укола засевают эталонные штаммы бактерий с известным колицином. Посевы инкубируют при 370 С сутки, после чего культуру убивают хлорамином. Затем по поверхности питательной среды в чашках Петри распределяют 3 мл расплавленного агара, смешанного с 0,2 мл 4-х часовой культурой E.coli неизвестного колицинотипа. Через 18-20 ч культивирования при 37о С отмечают результаты действия колицина. Если вокруг посевов эталонного штамма появляются зоны просветления в росте исследуемой культуры, то это не будут идентичными колициногенами. В идентичной по колицинам культуре зон просветлений не будет.