Занятие 10
Общая вирусология. Бактериофаги.
Применение бактериофагов в медицине
Студент должен:
• знать:
- принципы универсальной классификации вирусов;
- понятие о вирионе, ультраструктуре;
- методы культивирования вирусов;
- морфологию и ультраструктуру фагов; взаимодействие фагов с бактериальной клеткой, практическое применение фага;
• уметь:
- идентифицировать микробы с помощью фага;
- определять фаговар, выделять бактериофаги из объектов.
Вопросы для проверки исходного уровня знаний
1. Классификация вирусов. Структура и химический состав вирусов.
2. Особенности репродукции РНК- и ДНК-содержащих вирусов, плюс РНК- и минус РНК вирусов.
3. Типы взаимодействия вируса с клеткой. Стадии репродукции вирусов.
4. Методы культивирования вирусов. Индикация, идентификация вирусов.
5. Природа и свойства бактериофагов (фагов), особенности химического состава. Основные морфологические группы фагов. Анатомическое строение Т-четного фага.
6. Вирулентные фаги, стадии их взаимодействия с бактериальными клетками (продуктивная инфекция). Кривая одиночного цикла размножения фага.
7. Умеренные фаги, особенности их взаимодействия с бактериальной клеткой. Профаг, явление лизогении. Фаговая конверсия.
8. Выделение фага из окружающей среды. Определение титра фага методом Грациа.
9. Практическое применение фага: фагодиагностика, фаготипирование, фагопрофилактика и терапия.
Самостоятельная работа студентов
Задание 22. Рассмотреть чашки с «негативными» колониями вирулентных и умеренных фагов, отметить их отличия.
Методические указания к выполнению работы
1. Бактериофаги – вирусы бактерий, способные в них размножаться (продуцироваться), при этом бактериальные клетки лизируются. Такой тип взаимодействия с клеткой (продуктивная инфекция) характерен для вирулентных фагов. Умеренные фаги способны не только репродуцироваться в бактериальных клетках и вызывать их лизис, но и переходить в скрытое состояние (профаг), при этом бактерии остаются жизнеспособными и становятся лизогенными.
Рассмотреть на таблицах и электронограммах различные морфологические типы фагов, изучить анатомические строение Т-четного фага, зарисовать схему строения, отметив детали анатомической структуры.
2.Выделения бактериофага из испражнений, сточной воды, почвы. Иследуемый материал вносят в МПБ. Инкубируют в термостате (иногда добавляют те бактерии, к которым хотят выделить фаг), затем освобождаются от бактерий фильтрованием. Фильтрат засевают на чашки с агаром совместно с бактериями (к которым хотят получить фаг) и через сутки инкубации при 37 °С наблюдают на фоне роста культуры стерильные пятна – «негативные» колонии фага.
3. Метод агаровых слоев Грациа. Является точным методом титрования бактериофага и незаменим в работе с фагами. Титром фага называется количество фаговых частиц в 1 мл препарата фага. Испытуемый фаг и бактериальные клетки смешивают в пробирке с расплавленным 0,7 %-м агаром, смесь выливают в чашку с МПА, она застывает в виде второго верхнего слоя. После инкубации в термостате в этом слое размножаются бактерии, давая сплошной, равномерный рост. На месте попадания фаговых частиц происходит гнездный лизис и образуются «негативные» колонии. Количество образовавшихся «негативных» колоний соответствует количеству фаговых частиц, внесенных в слой агара, что дает возможность подсчитать титр фага.
Приготовление разведение фага (10–10):
0,7 %-й агар (45–50 °С) + 0,1 мл бактериальной культуры. Учет: на чашке с разведением 10 образовалось 150 «негативных» колоний. Титр – 150 × 10 = 1,5 × 10, т.е. такое количество фаговых частиц содержится в 1 мл фага.
Определить титр фага по готовым чашкам путем подсчета «негативных» колоний и умножения на указанное разведение.
4. Фаготипирование применяется для определения фаговара внутри идентифицируемого вида бактерий. Метод имеет существенное значение при дифференциации брюшнотифозных бактерий, стафилококков; он позволяет установить источник инфицирования. Отметить результаты фаготипирования:
а) стафилококков набором типовых фагов;
б) брюшно-тифозных бактерий – Vi-фагами.
Опыт ставится следующим образом: чашки с МПА по дну расчерчены на квадраты по числу использованных типовых фагов. Испытуемая культура засеяна на поверхность МПА газоном. На квадраты, соответствующие наименованиям, нанесены капли типовых фагов. Чашки выдерживают в термостате в течение 24 ч. На месте действия определенного бактериофага образовались пятна лизиса. Обозначения типовых фагов, давших лизис, соответствуют наименованию фаговара.
Например, изучаемая стафилококковая культура лизировалась фагами 29, 77 и 80. Фаговар = 29/77/80. Брюшнотифозные культуры подвергаются фаготипированию только тогда, когда они лизируются Vi-фагом. Он наносится на центральный квадрат чашки, засеянной изучаемой культурой. Типовые фаги В, С, Д и другие наносятся на квадраты вокруг центрального. Фаговар брюшно-тифозных бактерий записывается по фагу, вызвавшему лизис.
Рассмотреть демонстрацию лечебно-профилактических препаратов бактериофага. Примеры препаратов занести в тетрадь.