Окраска с использованием фуксинсернистой кислоты(ШИК-реакции)
Принцип метода:образование соединений фуксинсернистой кислоты с альдегидными группами соединений лилово-красного цвета.Последние возникают при окраске простейших и грибов.Лучше применять периодат калия(окраска по Шабадашу)
Окраска по Шабадашу.
-срез промыть дистиллированной водой
-поместить в р-р перйодата(400 мг йоднокислого калия или натрия+10 мл 0,2 нормального р-ра уксусной к-ты,на дне остается осадок)-на 5-10 мин
-сполоснуть в дистиллированной воде 3-10 мин
-пломестить в фуксинсернистую кислоту(! г чистого основого фуксина для фуксинсернистой кислоты,растертого в ступке до мелкого порошка,залить 210 мл кипящей дистиллированной воды,после взбалтывания в течение 5 мин остудить до 60-70 град С,затем профильтровать через фильтровальную бумагу,охладить до 50 град С,затем добавить 20 мл 1 нормальной соляной кислоты,охладить до 20-25 град С,добавить 1 г метабисульфита калия илои безводного бисульфита натрия.Раствор,вначале рубиново-красный,постепенно обесцвечивается,до полного обесцвечивания его держать плотно закрытым в темном прохладном месте от 12 час до 3 сут,фуксинсернистой кислотой можно пользоваться повторно,если она остается бесцветной--на 10-30 мин
-промыть в дистиллированной воде
-хорошо промыть в сернистой воде(200 мл водопроводной воды+10 мл 10%-го метабисульфита натрия+10 мл 1 норм.соляной кислоты,сернистой водой можно пользоваться повторно при хранении ее в плотно закрытой посуде.
-окрасить гематоксилином,напр.,Гарриса,с последующей дифференцировокой 1% водным раствором соляной кислоты и промывкой в щелочной воде до восстановления синеватой окраски ядер
-заключить в бальзам
РЕЗУЛЬТАТЫ:Препараты,окрашенныве по данной методике,напоминают окрашенные гематоксилином и эозином.Ядра клеток темного синевато-серого цвета,цитоплазма бледно-фиолетовая.Микоплазмы,грибы рода кандида,пневмоцисты,токсоплазмы,слизь,окрашиваются в красно-фиолетовый цвета,плесневые грибы,некапсулированные бактерии окрашиваются только гематоксилином.
8 Методы выявления НВ антигена
8а Окраска орсеином.
Данная окраска имеет наибольшее значение для диагностики гепатита В
Окраска по Шиката.
-срез поместить в 1-й раствор(9,5 мл 5%-го марганцовокислого калия+5 мл 3%-го раствора серной кислоты+85 мл дистиллировавнной воды)-на 10 мин
-поместить в 2% щавелевую кислоту на 10 мин
-промыть в проточной воде 5 мин,затем в двух порциях дистиллированной воды и двух порциях 70%-го этанола
-на срез налить краситель(орсеин 4 г,70% этанол-100 мл,концентрированной соляной кислоты-2 мл)-на 4 часа
-промыть в проточной воде 10 мин
-дифференцировать солянокислым этанолом
-заключить в бальзам
РЕЗУЛЬТАТ:в цитоплазме гепатоцитов на светло-коричневом фоне тканевых элементов выявляются крупные округлые темно-коричневые включения однородного строения.Аналогично окрашиваются ядра лимфоцитов в перипортальных инфильтратах
Эластические волокна,медно-белковые комплексы окрашиваются также в коричневый цвет.
Рез-ты во многом определяются качеством красителя.Встречаются реактивы,не окрашивающие специфический субстрат.Поэтому при смере реактива необходимо апробировать его на материале,где уже был получен положительный результат.
Редко реактив пригоден более 2 недель,поэтому нужен свежий.Но все же встречаются орсеины,окрашивающие цитоплазму гепатоцитов диффузно,особенно на секционном материале.Поэтому предложены другие методы.
8б Окраска резорцин-фуксином(по Сенба,1982 г):
( А.С.Логинов, Аруин Л.И.Клиническая морфология печени.М.,Медицина,1985 г,с.12)
1.Фиксация в 10% формалине,заливка в парафин
2.Обработка депарафинированных срезов течение 10 мин в смеси,содержащей из 5% перманганата калия(9,5 мл),3% серной кислоты(5 мл),дистиллированной воды до 100 мл
3.Обесцвечивание срезов в течение 10 мин в 2% щавелевой кислоте
4.Промывка в проточной воде
5.Сенсибилизация(в 2% железо-аммонийных квасцах или в 1% нитрате уранила)
6.Помещение срезов на 1-3 часа в раствор резорцин-фуксина.
Приготовление раствора:
К 200 мл 1% раствора основного фуксина добавляют 5 г резорцина.Раствор кипятят в широкой чашке(диаметром 25 см) при постоянном перемешивании примерно 30 мин
(пока объем не уменьшится вдвое),затем добавляют 25 мл 29% раствора хлорида железа
и кипятят еще 5 мин.Охлажденный раствор фильтруют и осадок промывают на том же фильтре дистиллированной водой до тех пор,пока вода не перестанет окрашиваться.
Осадок вместе с фильтром заливают 200 мл абсолютного спирта и кипятят в водяной бане 2-5 мин,восстанавливают объем испарившегося абсолютного спирта(до 200 мл)
и добавляют 4 мл НС1.Дифференцируют окрашенные срезы абсолютным спиртом,
затем 1% солянокислым спиртом 5 мин.После этого промыввают в воде,обезвоживают
и заключают в бальзам.
РЕЗУЛЬТАТЫ:НВ антиген,эластические волокна,желчные пигменты темно-синие или черные.
8в Высокоспецифичный метод для выявления НВ антигена по( ,1982 г).
1.Депарафинированные и доведенные до воды срезы обрабатывают метанолом,содержащим 0,6% перекиси водорода,в течение 20 мин для подавления эндогенной пероксидазы.
2.Промывают в трех сменах фосфатного буфера(рН 7,2)
3.Инкубируют в растворе пероксидазы(5 мг на 100 мл),нанесенном на срезы,в течение
30 мин при комнатной температуре во влажной камере
4.Промывают в буфере
5.Обрабатывают диаминобензидином
6.Промывают в буфере
7.Докрашивают ядра гематоксилином Майера
РЕЗУЛЬТАТЫ:включения НВ антигена темно-коричневого цвета
9 Импрегнация азотнокислым серебром.
Для выявления бактериальной флоры с успехом может быть применена импрегнация серебром,что может осуществиться как в тканях,так и в срезах.
9а Импрегнация по Левадити:
-кусочки тканей после фиксации хорошо промывают в воде-не менее 1 суток
-поместить в 96% этанол на 1 сут
-перенести в дистиллированную воду до удаления этанола(до тех пор,пока кусочки не потонут,но не более 1 сут)
-поместить в 2-3% р-р азотнокислого серебра в темной,наглухо закрытой банке при температуре 37 град С на 3-4 суток
-быстро сполоснуть в растворе пирогалловой кислоты(3-4 г+95 мл дистиллированной воды+5 мл 40%-го раствора формалина).затем положить в него при комнатной температуре на 1 сут
-промыть в воде
-залить в парафин
-приготовить срезы и заключить в бальзам
РЕЗУЛЬТАТЫ:ткань окрашивается в желто-коричневый цвета,бактерии-в черный
9б Импрегнация по Вартину-Старри:
-срез поместить в подкисленную воду(рН 3,8-4,4 бидистиллированная вода или кипяченая дистиллированная вода подкисляется 1% раствором лимонной кислоты)
-поместить в 1% раствор азотнокислого серебра в стаканчике,обернутом черной бумагой и предварительно подогретом до 43 град С,перенести в водяную баню или термостат при температуре 43 град на 30 мин
-срезы положить на стеклянные палочки и покрыть проявителем(готовится непосредственно перед употреблением в маленьком стаканчике,при сливании помешивается стеклянной палочкой предварительно нагретые в термостате до 56 град С 4 мл 2%-го раствора азотнокислого серебра+10 мл 5%-го желатина+5,4 мл 0,15% раствора гидрохинона),проявить в термостате при 56 град С без доступа света 5-12 мин(до приобретения срезов золотисто-коричневого или золотисто-желтого цвета)
-быстро и тщательно ополоснуть в подогретой до 56 град С водопроводной воде
-обезводить в этаноле восходящей крепости(70,96 и 100%0-по 15 мин
-заключить в бальзам.
РЕЗУЛЬТАТ:на желтом фоне выявляются черные бактерии
9в Импрегнация в срезах с докраской по Семенович(с докраской гематоксилином и эозином)
-срез поместить в 0,008 М ацетатного буфера с рН 3,6-соединить 18,5 мл 0,2 М уксусной кислоты(1,2 г кислоты растворить в 100 мл дистиллированной воды)+1,5 мл 0,2 М ацетата натрия(1,64 ацетата натрия растворить в 100 мл дистиллированной воды)+500 мл кипяченой дистиллированной воды-на 2 мин
-поместить в 1% раствор азотнокислого серебра в темной посуде при 56 град С-на 30 мин
-срез положить на стеклянные палочки и покрыть проявителем(15 мл 5%-го желатина+3 мл 2%-го азотнокислого серебра+1 мл 3%-го гидрохинона,при сливании помешивать стеклянной палочкой) при температуре 37 град С-10 мин
-промыть в двух порциях теплого ацетатного буферного раствора
-поместить в 5% раствор тиосульфата натрия
-промыть в дистиллированной воде 5 минут
-окрасить гематоксилином и эозином
-заключить в бальзам
РЕЗУЛЬТАТЫ:бактерии окрашиваются в черный цвета,ткани окрашены гематоксилином и эозином,но с желтоватым оттенком цитоплазмы и волоконистых структур