Приготування препаратів живих клітин мікроорганізмів
Підготовка предметних і покривних скелець. Препарати готують на предметних скельцях і накривають зверху покривними. Предметні скельця – це пластинки (76 x 26 мм) з тонкого скла з добре відшліфованими краями і товщиною, що не перевищує 1,2 – 1,4 мм. Більш товсті скельця порушують фокусування конденсора і знижують чіткість зображення, що утрудняє роботу з імерсійним об’єктивом. Покривні скельця мають такі розміри: 18 х 18, 20 х 20, 18 х 24 мм тощо при товщині 0,15 – 0,17 мм. Покривні скельця більшої товщини погіршують якість зображення.
Предметні та покривні скельця мають бути чистими і ретельно знежиреними, що особливо важливо при готуванні фіксованих препаратів. Для перевірки чистоти скла на його поверхню наносять краплю води. При достатньому знежиренні крапля розтікається рівномірно і не збирається в опуклі пухирці, що повільно висихають. Використані скельця витримують 1 – 2 год у хромовій суміші (1 л води, 50 г калію дихромату, 100 г технічної сульфатної кислоти), після чого обполіскують теплою водою і спиртом. У повсякденній роботі для вилучення жиру предметні скельця натирають шматочком мила, а потім витирають чистою бавовняною серветкою.
Зберігають чисті предметні скельця в сухому стані або в банках із притертими пробками, заповненими 96 %-м спиртом або сумішшю Никифорова. Виймати скельця варто пінцетом, тому що пальці залишають на їхній поверхні жирні плями. Перед уживанням скельця варто просушити на повітрі або протерти фільтрувальним папером, чистою тканиною. Покривні скельця повинні бути також добре вимиті, висушені і зберігатися в спеціальних коробках або чашках Петрі.
Відбір культури для дослідження.Мікроорганізми в лабораторних умовах вирощують у пробірках, колбах, чашках Петрі на щільному або рідкому поживному середовищах. Для відбору клітин із рідкого середовища використовують стерильні бактеріологічні петлі або піпетки. Мікроорганізми, що виросли на щільному середовищі, беруть петлями або препарувальними голками. При відборі необхідно дотримуватися таких правил, що запобігають забрудненню культури сторонніми мікроорганізмами:
1. Запалюють спиртівку або газовий пальник.
2. Пробірку з вихідною культурою в рідкому середовищі обережно обертають між долонями, а потім поміщають у ліву руку між великим і вказівним пальцями і тримають у похилому положенні. Якщо культура вирощена в щільному середовищі, поверхня з культурою мікроорганізмів має бути оберненою догори і добре видною.
3. Петлю тримають вертикально в полум’ї пальника і прожарюють до почервоніння дріт, потім нахиляють і обпалюють частину тримача, що примикає до неї.
4. Мізинцем і безіменним пальцями правої руки притискають до долоні зовнішню частину ватяної пробки, виймають її з пробірки і тримають у такому положенні, не торкаючись навколишніх предметів.
5. Край відкритої пробірки обпалюють у полум'ї пальника.
6. Обережно вводять стерильну петлю в пробірку з культурою. Щоб не пошкодити клітини на щільному середовищі, петлю спочатку охолоджують, доторкнувшись до внутрішньої поверхні пробірки або поживного середовища, вільного від мікроорганізмів. Легким рухом відбирають невелику кількість мікробної маси або краплю рідини з клітинами. Виймаючи петлю з пробірки, стежать за тим, щоб матеріал не торкався її стінок або країв.
7. Знову обпалюють у полум’ї пальника край пробірки, потім внутрішній кінець ватяної пробки і пробірку закривають. Якщо ватяна пробка займеться, на неї не дмухають і її не кидають, а негайно вводять усередину пробірки і затискають тліючі місця рукою.
8. Пробірку з культурою ставлять у штатив, а відібраний матеріал використовують для приготування препарату.
9. Клітини мікроорганізмів, що залишилися на петлі, спалюють у полум’ї пальника.
Відбір культур мікроорганізмів, що виросли на щільному середовищі в чашці Петрі, виконують у тій же послідовності: запалюють пальник, стерилізують петлю (або голку), після чого відкривають великим і вказівним пальцями лівої руки кришку чашки Петрі. Уводять стерильну петлю під кришку і торкаються нею поверхні середовища, вільної від колоній. Гаряча петля зумовлює розплавлення середовища. Знімають з поверхні невелику кількість мікробних клітин, кришку чашки негайно закривають. Матеріал на петлі використовують для приготування препарату або посіву. Прожарювання петлі (голки) знищує клітини, що залишилися на ній. При прожарюванні мокрої петлі може відбуватися розбризкування дрібних крапельок рідини разом з мікробними клітинами, тобто утвориться аерозоль. Тому прожарювання петлі починають з ділянки дроту, що передує кільцю. Клітини, що залишилися на петлі, підсихають, тримач переводять у вертикальне положення і прожарюють петлю.
З рідкого середовища мікроорганізми можна відбирати градуйованою або пастерівською піпеткою. При використанні пастерівської піпетки стерильним пінцетом надломлюють її тонкий запаяний кінець і злегка обпалюють усю піпетку. Стерильні піпетки, загорнені в папір, виймають за верхній кінець, закритий ватяним тампоном. Колбу (пробірку) з рідкою культурою беруть у ліву руку, піпетку – в праву між великим і середнім пальцями, затискаючи її верхній отвір вказівним пальцем. Якщо в піпетці рідини недостатньо, її набирають за допомогою гумової груші. Відібрану пробу використовують для приготування препаратів або посіву в нове поживне середовище. Не можна ставити брудну піпетку у штатив або торкатися нею навколишніх предметів. Її слід негайно опустити в дезинфікуючу рідину (0,5 – 3 %-й водний розчин хлораміну або 3 – 5 %-й водний розчин фенолу).
Приготування препаратів живих клітин. Живі мікроорганізми можна спостерігати в препаратах "роздавлена" і "висяча крапля". Для приготування препаратів у вигляді "роздавленої краплі" на середину чистого предметного скла нанести маленьку краплю води, перенести в неї невелику кількість досліджуваних мікроорганізмів, добре перемішати і накрити покривним склом. Якщо досліджувані мікроорганізми ростуть на щільному поживному середовищі, мікробну масу перенести у підготовлену краплю води за допомогою петлі, якщо в рідкому середовищі – суспензію клітин нанести на предметне скло стерильною піпеткою або за допомогою петлі, краплю води на предметне скло можна не наносити. Крапля з досліджуваним матеріалом має бути невеличкою, щоб після притискання її покривним склом з-під останнього не виступала зайва рідина. Зайву рідину видалити фільтрувальним папером. Підготовлений препарат поміститина столик мікроскопа, закрити затискачами. Препарат "роздавлена крапля" допомагає встановити форму, розміри клітин, їх розмноження, рухомість, наявність спор, реакцію клітинна хімічні подразники.
Для приготування препарату "висяча крапля" невелику краплю суспензії мікроорганізмів нанести на покривне скло, перевернути його краплею донизу і помістити на спеціальне предметне скло із заглибленням у центрі. Краї заглиблення заздалегідь змастити вазеліном. Крапля має висіти вільно, не торкаючись країв і дна заглиблення. Це дозволяє її вивчати впродовж кількох днів, спостерігаючи за ростом і розмноженням мікроорганізмів, утворенням і проростанням спор, рухомістю клітин.
Препарат "відбиток" готують для вивчення природного розташування в колонії клітин стрептоміцетів і міцеліальних грибів. Зі щільного середовища, на якому мікроорганізми ростуть суцільним газоном у вигляді колоній, вирізають скальпелем невеликий кубик або окрему колонію і переносять на предметне скло. Поверхня з мікроорганізмами має бути обернена догори. Потім прикладають чисте покривне скло, злегка надавлюють на нього петлею або голкою і негайно ж знімають, намагаючись не зрушити убік. Препарат поміщають відбитком вниз у краплю води або в розчин метиленової сині (1:40) на предметному склі і мікроскопують.
Фарбування живих клітин. Для виявлення деяких функціональних особливостей клітин і диференціації їхніх включень застосовують прижиттєве фарбування мікроорганізмів. Через токсичність барвників живі клітини фарбують нейтральним червоним, нейтральним фіолетовим, метиленовою синню, фуксином, еозином, еритрозином, зеленим янусом у дуже невеликих (0,001– 0,0001%) концентраціях. На предметному склі краплю досліджуваних мікроорганізмів змішують із краплею розчину барвника, накривають покривним склом і через 2 – 3 хв мікроскопують.
Уявлення про природну форму, величину, будову мікроорганізмів, їхні окремі структури (позаклітинний слиз) дають негативні препарати. Для негативного фарбування застосовують рідку туш, 3 %-й водний розчин конго червоного, 10 %-й розчин нігрозину й інші барвники, що не проникають у мікробні клітини. Краплю туші або розчину барвника змішують із краплею культури, накривають покривним склом і розглядають із сухими об’єктивами. Барвники заповнюють простір, що оточує клітину, і в результаті незабарвлені мікроорганізми чітко виділяються у вигляді яскраво освітлених безбарвних капсул на темному тлі препарату. Можна застосувати комбіноване негативне фарбування фону з прижиттєвим фарбуванням клітин.
Завдання на виконання
1. Ознайомитись з організацією мікробіологічної лабораторії та облаштуванням робочого місця мікробіолога, засвоїти правила техніки безпеки при роботі в лабораторії.
2. Вивчити будову біологічного мікроскопа.
3. Приготувати препарати "роздавлена крапля", використовуючи великі об’єкти (крохмаль кукурудзяний чи картопляний, зрізи листя, дріжджі).
4. Оволодіти технікою мікроскопування під час роботи з об'єктивами сухих систем (збільшення 8х і 40х) та імерсійних (збільшення 90х), використовуючи приготовлені препарати.
Опрацювання результатів
Після вивчення кожного з приготовлених зразків необхідно виконати рисунок у робочому зошиті (рис. 7): зображення яке було отримано при мікроскопіюванні, кожен рисунок слід підписати (вказати назву досліджуваного об’єкту під рисунком та у верхньому правому куті навести збільшення об’єктива, який використовувався).
×40
Дріжджі хлібопекарські
Рис.7.Приклад оформлення результатів у робочому зошиті.
Контрольні запитання
1. У чому полягають основні принципи організації мікробіологічної лабораторії та робочого місця мікробіолога?
2. У чому полягають правила техніки безпеки під час роботи в мікробіологічній лабораторії?
3. Які основні частини має оптичний мікроскоп? У чому полягають правила роботи з ним?
4. Як визначити основні характеристики оптичного мікроскопа?
5. У чому полягають особливості техніки мікроскопування із використанням сухих та імерсійних об'єктивів?
6. У чому полягають принципи таких методів мікроскопування, як темнопольна, фазово-контрастна, люмінесцентна, електронна мікроскопія?
7. Що таке предметні і покривні скельця? Для чого вони використовуються?
8. Як приготувати препарат "роздавлена крапля"?
9. Як приготувати препарат "висяча крапля"?
10. У якому разі використовують препарат "відбиток"?
ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 2