Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.
Антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности м.о., обладающие высокой физиологической активностью к определенным группам м.о., злокачественным опухолям, избирательно задерживающих их рост или полностью подавляющих их развитие.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам можно проводить методом агаровых блочков или с помощью бумажных дисков, пропитанных разными антибиотиками. Для этого готовят в стерильной водопроводной воде густую суспензию изучаемого микроорганизма путем смыва клеток водой с поверхности твердой питательной среды. Работая около пламени горелки, вносят по 3-5 капель полученной суспензии в пробирку с предварительно расплавленной и остуженной до 45-50 ºС питательной средой (ГРМ-агар). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и переливают в стерильную чашку Петри.
В качестве продуцентов антибиотиков используют актиномицеты. Их предварительно выращивают на агаризованных средах в чашках Петри. Стерильным пробочным сверлом (диаметр 6-8 мм) вырезают блочки с газона микроорганизма и переносят их на поверхность застывшей среды, засеянной изучаемой бактерией. Бумажные диски, пропитанные разными антибиотиками, помещают на поверхность засеянной бактерией среды на равном расстоянии друг от друга и на 1,5-2,0 см от края чашки.
Чашки Петри, не переворачивая, помещают в термостат (37 ºС) на 24 ч. Через сутки отмечают образование зон подавления роста исследуемых микроорганизмов вокруг агаровых блочков и дисков. Если исследуемая бактерия чувствительна к определенным антибиотикам, то вокруг блочков или дисков обнаруживаются зоны отсутствия роста культуры. Диаметр зоны подавления роста измеряют миллиметровой линейкой и записывают результаты. Зона более 30 мм свидетельствует о высокой чувствительности бактерий к антибиотику, а менее 12 мм – о слабой чувствительности.
Задание:
1. Подготовить к стерилизации пробирки с водопроводной водой для осуществления смыва выросшей бактериальной культуры со скошенной ПС (по 1 пробирке на каждого студента).
2. Приготовить агаризованную ПС типа ГРМ-агара для посева газоном бактериальной культуры в чашки Петри.
3. Подготовить чашки Петри к стерилизации (по 1 чашке Петри на каждого студента).
4. Осуществить посев бактериальной культуры в чашки Петри. Произвести вырез блочков из предварительно выращенных актиномицетов и перенос их на поверхность бактериального посева.
5. На следующем занятии оценить чувствительность бактериальных культур к антибиотическим веществам, продуцируемым разными актиномицетами.
Грибы.
Грибы - макро- и микромицеты, объединяют в группу эукариотических организмов. Вегетативное тело грибов – это сплетение тонких ветвящихся нитей гиф, составляющих мицелий. Диаметр гиф, составляющих вегетативные мицелий, колеблется от 5 до 50 мкм и более. Грибы различаются способом размножения (вегетативное, половое и бесполое), характером конидиального и спорангиального аппарата при бесполом размножении и образованием различных половых клеток при половом размножении: зигоспор, аскоспор, базидиоспор.
В зависимости от строения мицелия различают высшие и низшие грибы. У низших грибов мицелий представлен единой «гигантской» клеткой без перегородок. Например, рода Mucor, Syncephalastrum. Увысших грибов по мере удлинения гиф формируются перегородки – септы. Септа образует пору, через которую осуществляется транспорт питательных веществ. Каждая клетка такого мицелия отделена от другой клетки, таким образом формируется клеточный септированный мицелий. Например, рода Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium.
Род Mucor.
Мукоровые грибы называю «головчатая плесень», т.к. на поверхности субстрата появляются черные точки – спорангии. В спорангиях бесполым путем образуются споры. Споры могут быть округлыми, эллиптическими, гладкими, бесцветными или сероватыми. Цвет мицелия вначале белый, затем становится серовато-оливковый. Вид мицелия: войлокоподобный. Мукоровые грибы могут расти на поверхности влажного зерна, солода, корнеплодов, на стенах сырых помещений.
Род Fusarium.
Несовершенные грибы или дейтеромицеты. Гифы разнообразно разветвленные, с перегородками. На питательном субстрате образуют белые, розовые, желтые, красно-фиолетовые, коричневые колонии, поверхностные или погруженные в ПС. Пигмент нередко диффундирует в субстрат, окрашивая его в различные оттенки от розового до коричневого. Среди них есть паразиты, вызывающие заболевания злаков, корнеплодов, клубней, некоторые виды образуют ядовитые вещества.
Род Rhizopus.
Грибы рода Rhizopus поражают ягоды, корнеплоды, клубни, вызывают «мягкую гниль». Спорангии шаровидные или приплюснутые, сначала бесцветные, при созревании – черные (рис. 4).
Род Aspergillus.
Все аспергилловые грибы образую конидии, пигментированные в разные цвета (A.niger – черные конидии; A.terricola – желто-оранжевые; A.oryzae – оливковые). Конидеоносцы у аспергилл вздутые на вершине, в форме головки, на которых формируются выросты – фиалиды, на концах которых цепочки конидий (рис. 5). Аспергиллы появляются в виде налетов плесени на хлебе, который хранится при повышенной влажности. Есть паразиты животных и растений. Растут грибы при рН от 3 до 8. Оптимум рН 5-6. Оптимум температуры 20-25 °С. Но есть термофилы, например, A.niger растет при температуре 33-37 °С, A.fumigatus растет при температуре 45-50 °С. Все аспергиллы аэробы.
Рис. 4 Род Rhizophus. Рис. 5 Род Aspergillus
Род Penicillium.
Конидиальный аппарат выглядит в форме кисти, конидии чаще всего эллиптической формы, гладкие, шиповатые или слегка морщинистые. Отдельные колонии бесцветные, в массе зеленые, серовато-зеленые, сине-зеленые (рис. 6).
Рис. 6 Род Penicillium
Род Trichoderma.
Имеет многоклеточный мицелий, не имеет полового процесса. Размножаются бесполым путем при помощи конидий или вегетативно - участками гиф. Растет в виде рыхлых колоний с клочковатой или войлокоподобной поверхностью. Мицелий ползучий, быстро растущий, бесцветный, с возрастом становится темно-зеленым.
Задание:
1. Приготовить агаризованную ПС типа Сабуро (глюкоза – 4%, пептон – 1%, агар – 2%) для посева грибных культур в чашки Петри и в пробирки на скошенную ПС (по 1 чашке Петри и 1 пробирке на каждого студента).
2. Приготовить для стерилизации чашки Петри, пробирки, закрыть их ватно-марлевыми пробками и простерилизовать.
4. Произвести посев грибных культур штрихом на скошенную агаризованную среду и уколом в чашки Петри.