РОЗДІЛ 1 Білок NPRL2 та його біологічна роль

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ННЦ “Інститут біології”

Кафедра біохімії

Спеціалізація молекулярна біологія

Зав. кафедри проф., д.б.н. Остапченко Л.І.

Протокол № __ засідання кафедри

Від „___” _______ 2015р.

Оцінка взаємодії білка NPRL2 з компонентами мультиферментного комплексу аміноацил-тРНК-синтетаз

Дипломна робота

студентки IV-го курсу

денної форми навчання

Кулеші Альони Вікторівни

Робота виконана: лабораторія структурної ензимології та біохімії Національного центру наукових досліджень Франції в м. Жиф-сюр-Іветт

під керівництвом: доктор Марк Міранд

Оцінка захисту роботи ___________

Київ 2015

РЕФЕРАТ

Макромолекулярні комплекси, до складу яких входять аміноацил-тРНК-синтетази, є відмінною ознакою вищих еукаріот. Найбільшим представником є MARS, мульти-аміноацил-тРНК-синтетазний комплекс , який складається із дев'яти ферментів та трьох допоміжних білків. Аміноацил-тРНК-синтетази, окрім аміноацилювання транспортної рибонуклеїнової кислоти, виконують також неканонічні функції. Трансляція білків пов'язана із іншими метаболічними процесами та сигнальними шляхами, зокрема із mTOR-сигнальним шляхом, який об'єднує велику кількість ланок. Недавні дослідження показали, що білок NPRL2, складова частина комплексу GATOR1, який є інгібітором mTORC1 комплексу, взаємодіє із компонентами макромолекулярного комплексу аміноацил-тРНК-синтетаз, проте поки що невідомо з якими.

Зважаючи на важливість неканонічних функцій аміноацил-тРНК-синтетаз, їх вивчення зробить великий внесок у розуміння функціонування клітини та дасть можливість розробити ефективніші методи впливу на трансформовані клітини.

Робота присвячена пошуку партнерів білка NPRL2 у комплексі MARS шляхом оцінки його взаємодій між метіоніл-, глутамініл-, лізил-, аспартил-тРНК-ситетазою та р43. В роботі використовувались методи котрансфекції культури клітин людини, імунохроматографії та Вестерн-блот аналізу. В результаті роботи було показано, що група із п'яти компонентів мультисинтетазного комплексу не взаємодіє із білком NPRL2.

Робота викладена на … сторінках, містить 6 рисунків, було використано 47 літературних джерел.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

АРСаза	— аміноацил-тРНК-синтетаза
Ар₄А	— диаденозилтетрафосфат
Arc1p	— (aaRS cofactor 1) кофактор 1р аміноацил-тРНК-синтетаз
DMEM	— (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) поживне середовище для культур клітин еукаріот
еEF-1H	— “важка” форма фактору елонгації трансляції 1 (eEF1A, eEF1Bα, eEF1Bβ і eEF1Bγ)
EPRS	— глутаміл-проліл-тРНК-синтетаза
GATOR1	— комплекс-регулятор Rag ГТФаз
KRS	— лізил-тРНК-синтетаза
LRS	— лейцил-тРНК-синтетаза
mTOR	— (mechanistic (mammalian) target of rapamycin) серин-треонінова протеїнкіназа
MARS	— мульти-аміноацил-тРНК-синтетазний комплекс
MRS	— метіоніл-тРНК-синтетаза
MutS	— білок постреплікативної системи репарації місметчів у E. coli
NPRL2	— (nitrogen permease regulator-like 2) білок, учасник mTOR-сигнального шляху
QRS	— глутамініл-тРНК-синтетаза
TUSC4	— (tumor suppressor candidate 4) ген, який кодує NPRL2
Raptor	— білок, регуляторно-асоційований з mTOR
DEPTOR	— DEP-домен, що містить ділянку для взаємодії з mTOR.
PRAS40	— 40 kDa пролін-багатий субстрат для Akt-кінази.
VEGA	— (valyl-tRNA synthetase/elongation factor 1A/guanine exchange factors assembly) валіл- тРНК-синтетаза — еEF-1H комплекс

ЗМІСТ

ВСТУП…………………………………………………………………...
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ РОЗДІЛ 1 Білок NPRL2 та його біологічна роль…………………...
1.1. Ідентифікація гену TUSC4…………………………………... 1.2. Білок NPRL2 як продукт гену TUSC………………………. 1.3. Білок NPRL2 у mTOR-сигнальному шляху…………….
РОЗДІЛ 2 Мультиферментні комплекси аміноацил-тРНК-синтетаз……………………………………………......... 2.1. Мультисинтетазні комплекси вищих еукаріот………… 2.2. Неканонічні функції аміноацил-тРНК-синтетаз, компонентів мультиферментного комплексу MARS….
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА РОЗДІЛ 3 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ…………….. 3.1. Матеріали та реактиви………………………………..…. 3.2. Клітинна лінія……………………………………………. 3.3. Підготовка ДНК для трансфекції……………………….. 3.4. Підготовка клітин HeLa до трансфекції………………... 3.5. Підбір оптимальних умов трансфекції…………………. 3.6. Трансфекція клітин лінії HeLa з використанням реагенту Effectene Transfection Reagent………………... 3.7. Імунохроматографія з використанням гелю, що містив антитіла до мітки Flag……………………………..……... 3.8. Вестерн-блот аналіз……………………………………… 3.9. Візуалізація результатів досліду…………………...……
РОЗДІЛ 4 Результати та їх обговорення…………………………… 4.1. Визначення оптимальних умов трансфекції клітин HeLa реагентом Effectene……………………………..… 4.2. Умови проведення трансфекцій………………………… 4.3. Ідентифікація взаємодії між метіоніл-тРНК-синтетазою та білком NPRL2…………………………... 4.4. Ідентифікація взаємодії між глутамініл-тРНК-синтетазою та білком NPRL2……………...…………… 4.5. Ідентифікація взаємодії між аспартил-тРНК-синтетазою та білком NPRL2…………………………... 4.6. Ідентифікація взаємодії між лізил-тРНК-синтетазою та білком NPRL2…………………...………………………. 4.7. Ідентифікація взаємодії між р43, несинтетазним компонентом макромолекулярного комплексу MARS, та білком NPRL2…………..……………………………..
ВИСНОВКИ……………..........................................................................
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ........................................................................

ВСТУП

Важливою властивістю живих організмів є їх здатність до контролю анаболічних та катаболічних процесів. Утримання балансу між процесами розпаду та синтезу білків дозволяє виживати та функціонувати в умовах мінливого надходження необхідних речовин. Зокрема, у ссавців цю властивість забезпечує сигнальний шлях, у якому центральним елементом виступає протеїнкіназа mTOR (механічна мішень рапаміцину).

mTOR-сигнальний шлях функціонує у відповідь на різні сигнали навколишнього середовища клітини, контролюючи процеси утворення та використання великої кількості енергії і поживних речовин. Саме тому йому і приписують важливу роль під час росту та поділу клітини. Будь-які зміни у роботі цього шляху призводять до виникнення таких хвороб людини, як різні види раку, ожиріння, діабет ІІ типу та нейродегенеративні захворювання [1].

Відомо, що цей шлях включає в себе велику кількість як специфічних білків, так і таких, які виконують тут свою неканонічну функцію [2]. Зокрема, білок NPRL2 є частиною комплексу GATOR1, який в свою чергу є негативним регулятором mTOR-кінази. За неопублікованими даними групи директора Центру хіміотерапії раку (Токіо, Японія) доктора Наойї Фуджіти, цей білок взаємодіє із макромолекулярним комплексом аміноацил-тРНК-синтетаз.

Мульти-аміноацил-тРНК-синтетазний комплекс (MARS), молекулярна маса якого складає приблизно 1,5 MDа, було описано більше ніж 20 років тому, але його структурна і функціональна організація ще й досі є предметом дослідження. Даний комплекс присутній у вищих еукаріот починаючи від Drosophila і закінчуючи ссавцями [3]. До його складу входять дев'ять аміноацил-тРНК-синтетаз та три допоміжних білка (р18, р38, р43). Компоненти комплексу, взаємодіючи між собою, утворюють два структурні субкомплекси. Існує гіпотеза, що MARS може виконувати роль молекулярного центру для координації процесів біосинтезу білка та певних сигнальних шляхів у клітині [4]. Так, як процеси аутофагії та біосинтезу білка є залежними у певних умовах, цілком можлива участь компонентів одного сигнального шляху у іншому.

Метою нашої роботи була перевірка взаємодій між рекомбінантним білком NPRL2 та такими компонентами мультисинтетазного комплексу, як метіоніл-, глутамініл-, лізил-, аспартил-тРНК-синтетазами та білком р43. Для досягнення мети були поставлені завдання: котрансфікувати культури клітин HeLa відповідними векторами, що містять відкриті рамки зчитування зазначених вище білків, виділити можливі утворені комплекси за допомогою імунохроматографії та перевірити наявність обох цільових білків за допомогою Вестерн-блот аналізу.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

РОЗДІЛ 1 Білок NPRL2 та його біологічна роль

Ідентифікація гену TUSC4

Розвиток злоякісних пухлин з епітеліальних тканин є найбільш поширеним типом раку і вирізняється найвищим рівнем летальності. За даними Всесвітньої організації охорони здоров'я у 2012 році від раку померло близько 8,2 мільйонів людей, з них 1,59 мільйона від раку легень (19,4%), печінки — 0,8 мільйона (9,1%), шлунка — 0,7 мільйона (8,8%) та 0,5 мільйона (6%) від раку молочної залози [5]. Через актуальність даної проблеми є необхідним вивчення процесу розвитку різних видів раку та створення дієвих методів лікування.

Рак легенів розвивається внаслідок багатостадійного процесу, що включає безліч генетичних та епігенетичних змін домінантних онкогенів та генів-супресорів пухлин. Деякі з них можуть бути знайдені у клітинах епітелію, який ушкоджується під час паління, а також у фенотипово нормальних, неушкоджених клітинах. Для подальшої роботи з такими типами захворювань необхідно детально описати геном перероджених клітин. Найважливішою інформацією є ідентифікація потенційних онкогенів та генів-супресорів.

Дані багатьох досліджень свідчать, що делеція ділянки хромосоми у регіоні 3р21.3 спостерігалась при вивченні деяких видів раку, зокрема раку легенів, молочної залози, шийки матки, яєчників та нирок [6–9]. Так, при аналізі геному траснформованих клітин легенів та молочної залози було визначено ділянки розміром у 630 та 120 тисяч пар нуклеотидів відповідно, втрата яких призводить до їх трансформації [6,10,11]. Ці ділянки було проналізовано та знайдено 9 генів, які вважають потенційними супресорами пухлин: делеції чи мутації цих генів є типовими для ракових клітин. Серед цих генів було знайдено і TUSC4 (потенційний супресор пухлин 4).