РОЗДІЛ 3 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Матеріали та реактиви
У роботі було використано реактиви:
eкстракт дріжджів, бакто-триптон, агар (“Oxoid”, Великобританія), набір для виділення та очищення плазмідної ДНК QIAGEN-tip 500-Max (QIAGEN, Німеччина); реагенти для трансфекції клітин Effectene Transfection Reagent (QIAGEN, Німеччина); середовище DMEM, ембріональна теляча сироватка (FBS), суміш антибіотиків пеніциліну та стрептоміцину, L-глутамін, розчин, що містить хелатуючий агент ЕДТА - Versene (всі реагенти - Gibco, Life Technologies, США); поліакриламідні гелі для аналізу білків Any kD MiniPROTEAN TGX Gel; концентрований трис-гліциновий буфер без додецилсульфату натрію (BioRad, США); маркер молекулярної маси білків Pierce Unstained Protein Molecular Weight Marker (ThermoScientific, США); набір для переносу білків на нітроцелюлозну мембрану TransBlot Turbo Nitrocellulose Transfer Packs (BioRad, США); хемілюмінесцентний субстрат і проявник SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (ThermoScientific, США); натрію додецилсульфат, Triton X100, Tween 20%, гліцерол, бета-меркаптоетанол, інгібітори протеаз бензамідин і пефаблок (все - SigmaAldrich, США), знежирене сухе молоко.
Антитіла: AntiFLAG M2 (SigmaAldrich, США); AntiMouse HRP, AntiRabbit IgG (Chemicon, США); антитіла, які було отримано у лабораторії раніше - AntiR3 CHO_3pur, IgG MTS-T 14/04/85 , IgG1 Gln-DEAE 14/04/85, IgG anti cKRS DN lapin 117 25/04/02, IgG AspRS DN20 13/12/96, IgG anti human p43 Ct lapin 052 30/05/00.
Всі розчини готували на деіонізованій та вільній від нуклеаз воді.
Обладнання: ручний автоматичний лічильник клітин Scepter 2.0 Cell Counter (Millipore); СО2-інкубатор для культур клітин MCO20AIC (Sanyo, Японія); мікроцентрифуги Heraeus Pico 17 та Heraeus Fresco 21 (ThermoScientific, США), центрифугa Beckman J20 зі змінними роторами різного діаметру (Beckman, США); система візуалізації поліакрамідних гелів Gel Doc EZ System (BioRad, США); система напівсухого переносу білків на мембрану Trans Blot Turbo Transfer Starter System (BioRad); система для проведення інкубацій для Western-blot аналізу Bench-Pro 4100 Card Processing Station (Invitrogen); система Luminescent Image Analyzer LAS3000 (Fujifilm Life Science); ; спектрофотометр Varian «Сагу50» (Varian, США).
Плазмідну конструкцію pc5FLAG/TUSC4 люб'язно надав директор Центру хіміотерапії раку (Токіо, Японія) доктор Наойя Фуджіта, конструкції pCMV6-XL5/MRS, pCMV6-XL5/QRS, pCMV6-XL5/KRS, pCMV6-XL5/DRS, pCMV6-XL5/p43 – були створені, перевірені та очищені раніше у лабораторії.
Клітинна лінія
В якості експериментальної модельної системи було використано HeLa HC – безсмертна лінія клітин, отримана із ракової пухлини (карциноми) шийки матки. Клітини інкубували в середовищі DMEM з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки, 2мМ L-глутаміну та суміші антибіотиків пеніциліну (50 од/мл) та стрептоміцину (50 мкг/мл) в умовах 5% СО2, 100% вологості при температурі 370С.
3.3. Підготовка ДНК для трансфекції
Бактеріальні колонії, які містили рекомбінантні плазміди на основі вектору pCMV6-XL5 було ізольовано та висіяно у 150 мл рідкого поживного середовища з додаванням ампіциліну. Культури інкубували при 370С протягом 16 годин до досягнення культурою щільності 0,35-0,4 OD.
Для отримання плазмідної ДНК використовували набір для виділення та очищення плазмідної ДНК QIAGEN-tip 500-Max (QIAGEN). Процедуру виконували згідно протоколу. По закінченню вимірювали концентрацію отриманого матеріалу методом спектрофотометрії та зберігали його при -200С.
3.4. Підготовка клітин HeLa до трансфекції
Культуру клітин HeLa вирощували у матрацах для культивування площею 75 см2 з додаванням збагаченого середовища DMEM до досягнення конфлюентності 80%. Після чого вживане середовище відбирали, додавали 2 мл хелатуючого реагенту Versene та інкубували 20-30 сек для відокремлення адгезованих клітин від поверхні. Відокремлені клітини суспензували з додаванням 8 мл нового середовища.
Для підрахунку кількості клітин використовували ручний автоматичний лічильник клітин Scepter 2.0 Cell Counter (Millipore). Підрахунок проводили згідно інструкції до приладу. Відому кількість клітин розводили у збагаченому середовищі DMEM до концентрації 0,25*106 клітин/мл.
Для трансфекції використовували 0,5*106 клітин, які висівали у 10 мл поживного середовища у пластикових чашках Петрі (діаметр 8 см, площа поверхні 56,7 см2). Культури вирощували 24 години в умовах 5% СО2, 100% вологості при температурі 370С.
За дві години до трансфекції середовище у чашках з культурами замінювали свіжим.