БИОТЕХНОЛОГИЯ БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВ

Спиртовое брожение

Спиртовое брожение играет большую роль в жизни человека. Дрожжи традиционно используют в хлебопечении, для получения спирта и многих других продуктов. По значимости для народного хозяйства с ними могут конкурировать только молочно-кислые бактерии. Пожалуй, нет на земном шаре ни одного человека, который бы в своей повседневной жизни не пользовался «трудами» этих микроорганизмов.

На Востоке в качестве продуцента спиртового брожения при производстве рисового пива (сакэ) применяется Aspergillus oryza. Его могут вызывать также некоторые бактерии (Zymomonas mobilis, Z. anaerobica, Sarcina ventricula, Erwinia amylovora). Однако получение спирта с помощью этих микроорганизмов промышленного значения пока не имеет.

Термином «дрожжи» обозначают одноклеточные эукариотные микроорганизмы, которые в зависимости от наличия полового процесса и его типа относят к трем классам грибов: Ascomycetes, Basidio-mycetes и Deuteromycetes. В строгом смысле он не имеет таксономического значения.

К классу Ascomycetes относят дрожжи, образующие при половом размножении сумки (аски) с эндогенными спорами. К нему принадлежат представители родов дрожжей, используемых в бродильных производствах, — Saccharomyces и Shizosaccharomyces.

В процессе эволюции дрожжи хорошо приспособились к обитанию в различных местах, содержащих чаще всего углеводы. Они растут на поверхности сладких плодов, в нектаре цветков, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в лесной подстилке и почве. Встречают-ся дрожжи и в водоемах. Содержатся они в пищеварительном тракте человека и животных. Большинство дрожжей - сапрофиты, но среди видов, находящихся во внутренних органах и на кожных покровах человека, имеются патогенные или условно патогенные формы, например, возбудитель кандидомикозов - Candida albicans. Некоторые дрожжи вызывают болезни растений.

Физиология дрожжей и биохимические основы спиртового брожения.Из соединений углерода дрожжи, как правило, лучше всего используют гексозы. Некоторые виды хорошо растут на средах с пеи-тозами. Из полисахаридов чаще всего утилизируют инулин и крахмал. Известны дрожжи, растущие на средах с углеводородами и некоторыми спиртами, в том числе метанолом и этанолом, а также органическими кислотами и другими углеродными субстратами.

В качестве источника азота дрожжи используют обычно соли аммония, аминокислоты, небольшие пептиды, реже нитраты и нитриты. Некоторые виды нуждаются в одном или более витаминах (чаще в биотине и тиамине), другие способны все необходимые для роста витамины синтезировать сами.

Большинство дрожжей растет в границах рН от 3,0 до 8,0, оптимальные значения — от 3,5 до 6,5. Общий диапазон температур для их развития довольно широк: от 0 (даже -7 ^вС) до 48 — 50 °С. Оптимальными для большинства видов будут 28 — 30 °С, по некоторые расы дрожжей, например используемые в пивоварении, имеют более низкий температурный оптимум. Известны также облигатно-псих-рофильные дрожжи, не растущие при температуре выше 18-20 °С. Многие дрожжи - факультативные анаэробы. В условиях анаэробиоза они получают энергию в результате сбраживания углеводов, а в присутствии молекулярного кислорода — за счет аэробного дыхания.

Спиртовое брожение у дрожжей до образования пировиноград-иой кислоты отличается от гликолиза у высших организмов лишь последними этапами, на которых вместо молочной кислоты образуется этиловый спирт. Обусловлено это наличием у дрожжей пируватде-карбоксилазы, катализирующей превращение пирувата в ацетальде-гид, который затем восстанавливается в этанол.

Гликолитическим путем (или путем Эмбдена — Мейергофа — Парнаса), который также называют фруктозобисфосфатиым (ФБФ-путь), осуществляется разложение глюкозы, галактозы, фруктозы и манно-зы. Олигосахариды вначале гидролизуются соответствующими ферментами до гексоз.

Существовало мнение, что дрожжи используют пентозы лишь в аэробных условиях. В последнее время установлено, что некоторые из них способны к росту в анаэробных условиях на средах, содержащих ксилозу или ксилулозу; последние подвергаются брожению с образованием этанола. Это имеет важное практическое значение для производств, перерабатывающих в спирт древесину и отходы сельскохозяйственных растений.

Разложение пентоз и высших спиртов осуществляется дрожжами через пентозофосфатный и ФБФ-пути. Спирты вначале дегидрируются до соответствующих гексоз и пентоз.

Брожение предполагает строгое равновесие процессов окисления и восстановления. Поэтому НАД, восстановленный на одном из этапов брожения, должен окисляться на другом этапе. Последнее происходит одновременно с восстановлением ацетальдегида в этанол. Такой процесс Нейберг назвал первой формой брожения. Суммарная реакция его:

Глюкоза -> 2С0₂ + 2 этанол

Ход брожения может заметно меняться в зависимости от конкретных условий. Если в культуру бродящих дрожжей добавить бисульфит натрия, который связывает ацетальдегид, он исключается из последующего процесса и блокируется:

Ацетальдегид + Na₂S₂0₃ -> Ацетальдегид (связанный)

В таких условиях акцептором электронов (водорода) от НАДН становится дигидроксиацетонфосфат, превращающийся в глицерин-3-фосфат, а затем в глицерин (вторая форма брожения по Ней-бергу). Суммарная реакция соответствует уравнению

Глюкоза -> Глицерин + Ацетальдегид (связанный) + С0₂

Суммарное количество синтезированной АТФ при такой форме брожения равно нулю, и, следовательно, процесс не может обеспечить рост клеток, но его используют в промышленности для получения глицерина.

Сходный вариант спиртового брожения наблюдается при выращивании дрожжей в щелочной среде. В этих условиях ацетальдегид окисляется НАД-зависимой дегидрогеназой в уксусную кислоту. Образовавшийся на этой стадии НАДН используется для восстановления эквивалентного количества ацетальдегида в этанол. Получающийся при окислении 3-фосфоглицеринового альдегида, он применяется одновременно и для восстановления дигидроксиацетонфосфата в гли-церин-3-фосфат, который затем превращается в глицерин (третья форма брожения по Нейбергу). Суммарная реакция выражается уравнением

2 глюкоза + Н₂0 —> 2 глицерин + Этанол + Уксусная кислота + 2С0₂

Такой химизм процесса благоприятен для клеток, поскольку образующаяся уксусная кислота снижает рН среды, после чего вновь возобновляется нормальное спиртовое брожение. В начальной его стадии дигидроксиацетонфосфат также выполняет роль акцептора электронов до того момента, пока не накопится ацетальдегид, необходимый для окисления НАДН. Этим объясняется наличие в начале брожения своеобразного периода индукции, во время которого появляется глицерин. Одновременно 3-фосфоглицериновый альдегид превращается согласно реакциям ФБФ-пути в пировиноградную кислоту, последняя затем декарбоксилируется в ацетальдегид. Но последний не может восстанавливаться в спирт, так как НАДН использован для выделения глицерина из дигидроксиацетонфосфата. Поэтому при образовании в процессе брожения одной молекулы глицерина накапливается одна молекула пировиноградной кислоты или ацетальдегида, которая не превращается в этиловый спирт. Спиртовое и глицеринпи-ровиноградное брожения тесно связаны. Вначале преобладает глице-ринпировиноградный его вид, но даже в период бурного брожения наряду со спиртом обнаруживаются другие продукты.

В присутствии молекулярного кислорода дрожжи быстро переключаются с брожения на аэробное дыхание. При этом пировино-градная кислота, образующаяся из глюкозы и других субстратов, окисляется через цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) до С0₂ и Н₂0. Кроме того, ЦТК обеспечивает клетки рядом метаболитов, необходимых для дальнейших биосинтетических реакций. В энергетическом отношении дыхание более выгодно, чем брожение. Поэтому в аэробных

условиях дрожжи растут лучше и образуют большую биомассу. При выращивании их в аэробных условиях на средах с этанолом или ацетатом помимо ЦТК важное значение имеет функционирование у них глиоксилатного шунта.

Подавление брожения в аэробных условиях носит название эффекта Пастера. Он связан, видимо, с различием энергетического заряда клеток в аэробных и анаэробных условиях. Дыхательная система и субстратное фосфорилирование конкурируют за АДФ. Кроме того, значение имеет аллостерическая регуляция фосфофруктокиназы. Фермент ингибируется АТФ и активируется АМФ. В анаэробных условиях содержание АТФ низкое, а активность фермента высока, в аэробных — отношение АТФ : АМФ повышается и активность фосфофруктокиназы снижается. Известно также, что аллостерическим ингибитором последней является цитрат — промежуточный продукт ЦТК.

Спиртовое брожение может происходить в условиях значительной
аэрации при высоком содержании глюкозы в среде (1,5 — 2,0 %).
Подавление аэробного дыхания при высокой концентрации глюкозы
(высокой скорости ее усвоения) называется эффектом Крэбтри, или
катаболитной репрессией. Этот эффект не наблюдается при выращи
вании дрожжей на средах, содержащих менее усваиваемые сахара.
Катаболитиая репрессия аэробного дыхания не только снижает полу
чение дрожжами энергии, но и подавляет биосинтез промежуточных
продуктов ЦТК и гликосилатиого цикла. В таких условиях необходи
мые для биосинтеза кислоты ЦТК образуются путем карбоксилирова-
ния пирувата: _Пи_РУват-

it ._, т-гл карбоксилаза

Пируват + АТФ + С0₂ + Н₂0------------- >Оксалоацетат + АДФ + ф_н

Выше уже указывалось, что в начале спиртового брожения преобладает глицеринопировиноградпое брожение, приводящее к образованию глицерина и пировиноградной кислоты. Однако последняя обнаруживается, как правило, в небольших количествах, поскольку основная ее часть идет на образование различных вторичных продуктов. К ним относятся уксусная, молочная, янтарная, пропиоиовая, муравьиная и некоторые другие кислоты, ацетон, диацетил, ацетоин, 2,3-бутан-диол, различные альдегиды и сложные эфиры.

При сбраживании дрожжами Сахаров обычно накапливается небольшое количество £(-)-молочной кислоты. Исключением является SaccH. veronae, синтезирующий £(+)-молочную кислоту. К продуктам брожения, образующимся из пировиноградной кислоты в небольшом количестве, относятся также лимонно-яблочная и диметил-глицериновая кислоты.

Кроме вторичных продуктов при спиртовом брожении образуются побочные продукты — высшие спирты, известные под названием сивушных масел. Почти половину общего их количества составляют два изоамиловых спирта: 3-метилбутанол-(1) и 2-метилбутанол-(1).

Наряду с ними в сивушном масле содержатся изобутилеиовый, и-бу-тиловый, м-пропиловый и ароматические спирты (р-фенилэтиловый, р-оксифеиилэтиловый). Эти продукты синтезируются из соответствующих кетокислот, образующихся в результате метаболизма углеводов, или из аминокислот. Поэтому вторичные и побочные продукты невозможно строго разграничить. Они существенно влияют на вкус и аромат готового продукта; накопление их не коррелирует с образованием этанола, и сброженные растворы, содержащие одинаковое количество спирта, могут отличаться по вкусовым и ароматическим качествам.

Образование высших спиртов включает дезамииировапие аминокислоты в кетокислоту, которая декарбоксилируется в альдегид; последний восстанавливается в спирт.

Однако не все высшие спирты синтезируются из аминокислот. Второй путь их образования можно рассматривать как биосинтез из продуктов метаболизма углеводов. Так, при конденсации пировино-градной кислоты с уксусным альдегидом или с ацетил-КоА образуется ацетомолочная кислота, которая превращается в 2-кетоизовалериапо-вую кислоту. В результате ее декарбоксилирования получается изо-масляный альдегид, восстанавливающийся в изобутанол.

Полагают, что некоторые высшие спирты могут синтезироваться обоими путями (из аминокислот и углеводов), другие — только из продуктов метаболизма углеводов.

При спиртовом брожении образуются также серосодержащие вещества — сероводород и сульфиты. Последние могут быть в форме ионов бисульфит HSO3 или сернистой кислоты (H₂S0₃). Синтез этих веществ связан со способностью дрожжей восстанавливать SOx^2- в S2- через сульфит (SO| ). Восстановление сульфатов в сульфиты зависит от свойств штамма дрожжей. На образование H₂S влияют интенсивность брожения и присутствие ионов меди и цинка.

Из других серосодержащих веществ в незначительном количестве могут образовываться меркаптаны (этилмеркаптаны, метилмеркапта-ны) — летучие вещества с неприятным запахом. Выделение С0₂ при брожении способствует удалению этих веществ из среды.

Характеристика дрожжей, применяемых в промышленности.Дрожжи, используемые для получения спирта, относятся в основном к роду Saccharomyces. Он включает семь видов, размножающихся вегетативно преимущественно в диплоидной фазе: Sacch. cerevisiae, Sacch. kluyveri, Sacch. exiguus, Sacch. dairensis, Sacch. servazzii, Sacch. tellustris, Sacch. unisporus. Как синонимы Sacch. cerevisiae рассматриваются Sacch. bayanus, Sacch. carlsbergensis и ряд других названий промышлешю важных дрожжей.

Наибольшее значение имеет Sacch. cerevisiae. К этому виду относятся расы дрожжей, используемые в хлебопечении, спиртовом производстве, пивоварении, виноделии, при изготовлении кваса. Поэтому приводим характеристику вида.

Saccharomyces cerevisiae Harisen. На солодовом сусле в трехсуточнойкультуре при 28 °С клетки имеют сферическую, эллипсоидальную или несколько удлиненную формы, располагаются единично или парами, иногда образуют короткие цепочки или мелкие грозди. В зависимости от размера клеток штаммы этого вида можно разделить на три морфологические группы.

К первой группе относятся штаммы, имеющие самые крупные клетки ((3,5 + 10,5) х (5,0 -5- 21,0) мкм), ко второй — с наименьшими ((2,5 -5-7,0) х (11,0 + 19,0) мкм), к третьей — промежуточные ((3,5 + -s-8,0) х ((5,0 -5- 11,5) -5- 18,0) мкм). Некоторые из них образуют удлиненные клетки, достигающие 30 мкм и более.

Колонии у этих дрожжей пастообразные, кремовые или коричневато-кремовые, обычно с довольно ровной, гладкой, иногда слегка пузырчатой или покрытой точками поверхностью с блестящими или тусклыми секторами. Край колоний цельный, иногда лопастный, изредка образуется примитивный псевдомицелий.

Аски обычно содержат от одной до четырех спор шаровидной или эллипсоидальной формы. Их образование легко вызвать при высеве дрожжей на агар с ацетатом.

Получение этилового спирта. Вэпоху промышленного прогресса спирт широко применяют как растворитель и химическое сырье для производства синтетического каучука. В настоящее время в нашей стране большая часть этилового спирта используется на технические нужды, остальная — в медицине и для других целей.

В процессе спиртового брожения, как отмечалось выше, наряду с основным продуктом брожения — этанолом — образуются побочные продукты: глицерин, высшие спирты, сивушные масла, альдегиды, органические кислоты, эфиры, углекислый газ. Большинство из них находит практическое применение. Сивушное масло и эфироальдегидную фракцию выделяют при ректификации этилового спирта и выпускают в виде технических продуктов. Углекислый газ улавливают, очищают от сопутствующих примесей и превращают в жидкую углекислоту. Ее используют в разных целях, в том числе для газирования воды, пива и безалкогольных напитков; она эффективна при сварочных работах как защитный агент против окисления швов, а также в литейном и других производствах. Сухой лед, получаемый из сжиженного углекислого газа, применяют в качестве хладоагента в пищевой промышленности, медицине, машиностроении и энергетике. Выделенную после брожения биомассу дрожжей употребляют в хлебопечении, а на барде после отгонки спирта выращивают кормовые дрожжи.

Сырьем для производства спирта служат разнообразные растительные материалы, содержащие в достаточном количестве сбраживаемые сахара или другие углеводы, которые можно осахарить. Наиболее широко используются крахмалосодержащие зерно (рожь, пшеница, кукуруза, ячмень, овес, просо) и картофель, сахаросодержащие меласса (отход сахарного и крахмало-паточного производства), дефект-

пая сахарная свекла, а также древесина и отходы сельскохозяйственных растений. Дальнейший рост производства спирта будет идти в основном по пути увеличения мощностей предприятий, применяющих непищевое сырье.

Процесс производства спирта из крахмалистого сырья включает ряд стадий (рис. 12). Вначале его измельчают и разваривают с целью извлечения и растворения крахмала. Поскольку последний не подвержен действию ферментов дрожжей, способных сбраживать только дисахариды и моносахариды, охлажденную разваренную массу обрабатывают амилолитическими ферментами солода (пророщенного зерна) или грибов (A. oryzae, A. niger и др.). Осахаренная масса (затор) содержит смесь углеводов, состоящую из мальтозы, глюкозы и декстринов. Кроме того, в ней имеются пептиды, аминокислоты, фос-форорганические соединения, минеральные соли и микроэлементы.

Далее стадия — сбраживание осахаренной массы. На отечественных спиртовых заводах применяют периодический и непрерывно-поточный способы брожения. Для этого используют естественно-чистые культуры дрожжей. Для подавления в них размножения бактерий пастеризованный и охлажденный до 30 °С затор подкисляют серной кислотой до значений рН, равных 3,8 — 4,0. Они, конечно, менее благоприятны для развития дрожжей, чем рН 4,5 — 5,0, но медленное их размножение компенсируется возможностью получения практически чистой культуры в нестерильных условиях.

Спиртовые дрожжи, применяемые при переработке крахмалистого сырья, должны обладать высокой бродильной активностью, быстро и полностью сбраживать сахара, а также использовать другие компоненты питательной среды в анаэробных условиях, быть устойчивыми к продуктам своего обмена (особенно к спирту), хорошо противостоять развитию инфекции. Уже около 70 лет применяют Sacch. cerevisiae, раса XII. Эти дрожжи отлично сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, на */з — раффинозу, несколько слабее галактозу. В среде накапливают до 10 — 11 % спирта. Раса XII — верхнебродя-щая, хорошо распределяющаяся во всем объеме затора, пылевидная, не образует хлопьев. Оптимальная температура ее развития от 30 до 38 "С, максимальная — 38 "С, минимальная — 5 °С. Значение рН во время брожения поддерживают в пределах 3,8 — 4,0. Используют также другие расы дрожжей, но не так широко. После сбраживания заторов остаются неиспользованными около 0,1 % галактозы, 0,4 % декстринов и 0,5 % пентоз.

Проводится селекционная работа по получению рас дрожжей с более высокими производственно ценными свойствами, в частности, способных интенсивно использовать галактозу и декстрины. В последние годы большое внимание уделяется селекции термотолерантных рас, дающих в промышленном производстве ряд преимуществ (ускорение микробиологических процессов, уменьшение расхода хладо-агента и др.).

.148

Зерно

Картофель

Солодовое зерно

Очистка