Получение ризоторфина (нитрагина)

Сложность азотного питания растений сводится к тому, что запасы доступных для них соединений этого элемента в почве незначительны. С урожаем зерновых ежегодно выносится из почвы 50 — 90 кг азота на каждые 10 ц зерна. Азотфиксаторы же создают естественное пло­дородие почвы, и человечество до появления химически связанного азота использовало лишь биологический азот.

В настоящее время азотфиксирующих микроорганизмов известно довольно много. Среди них есть и симбиотические, и свободноживу-щие виды. Наибольшее же значение для повышения урожая сельскохо­зяйственных культур имеет использование клубеньковых бактерий. Азотфиксирующие микроорганизмы, образующие клубеньки на кор­нях бобовых, относят к родам Rhizobium nBradirhizobium. Бактерии «узнают» своего хозяина (бобовое растение) по гликопротеипу — лектииу, расположенному на корневых волосках. При внедрении Rhizo­bium в корневые волоски образуются так называемые инфекционные нити, в которых находятся размножающиеся бактерии и которые про­никают в кору корня и достигают тетраплоидных клеток, после чего начинают формироваться клубеньки. В зрелом состоянии в послед­них на продольном срезе можно выделить четыре типа тканевой диф­ференциации: кора, меристема, сосудистая система и бактероидная зона. Последняя занимает центральную часть клубенька, причем в начале его формирования клетки находятся в обычной форме, а затем образу­ют бактероиды, которые фиксируют молекулярный азот. Появление клубеньков происходит во время развития первых настоящих листьев (в том числе и у однолетних растений). Функционируют они недол­го — некроз начинается во время цветения растения. Часть бактеро-идиых клеток лизируется, другая попадает в почву в виде мелких кокков. Фиксация молекулярного азота клубеньковыми бактериями ведет к образованию аммиака, из которого затем синтезируются ами­нокислоты. Этот процесс часто сопровождается выделением молеку­лярного водорода:

N2+ 8Н++ 8е + пАТФ -> 2NH3+ H2+ пАДФ + пФ

Многие клубеньковые бактерии содержат гидрогеназу, которая катализирует окисление водорода, в результате чего происходит его рециклизация. В образовании из азота аммиака и водорода участвует иитрогепаза — фермент, состоящий из компонента I — молибдофер-редоксина (железомолибденсодержащий белок) и из компонента II — азоферредоксипа (железосодержащий белок).


Нитрогеназа образуется и активна лишь в анаэробных условиях, поэтому в клубеньках имеется железосодержащий пигмент — легге-моглобии, который обратимо связывает молекулярный кислород. В последние годы показана возможность фиксации азота и чистыми культурами некоторых азотфиксаторов в условиях низкого парци­ального давления кислорода.

Сразу после открытия явления симбиотрофиой фиксации молеку­лярного азота возникла мысль использовать ее для практических це­лей. Сначала для этого применяли почву, на которой выращивались бобовые культуры, ее разбрасывали па площадях для посева бобовых там, где они раньше не выращивались. Более эффективным оказа­лось собирание с их корней клубеньков, которые затем подсушивали и топко размельчали. Таким материалом, с добавлением талька и бен­тонита, обрабатывали семена бобовых перед посевом.

В 1896 г. в Германии Ноббе и Гильтпер изготовили препарат, содержащий смесь клубеньковых бактерий, — нитрагин. В нашей стра­не в 30-х гг. XX в. такой препарат получали на торфе и называли ризоторфипом. Он наиболее эффективен при использовании под сою, люпин, люцерну, кормовые бобы. При этом наряду с увеличением урожая за счет существенного повышения содержания белка в расте­ниях улучшается его качество. Процесс производства ризоторфииа включает следующие стадии.

A. Выращивание и хранение культуры клубеньковых бактерий.
Для этого используют растительные экстракты (отвары бобовых куль­
тур), а также дополнительно обогащают сахарами (глюкозой, смесью
сахарозы с глюкозой) или маниитом. Пробирки со скошенным агаром
засевают соответствующим штаммом и выдерживают при 28 — 30 "С
от 4 до 10 сут. Выращенные культуры хранят в холодильнике (3 —
5°С).

Б. Получение жидкой культуры (инокулята). Оно происходит по­средством культивирования в качалочных колбах или 5-литровых бутылях. При этом в первую емкость на 750 мл наливают 200 мл среды, а во вторую — 2 л. Бактериями с одного косяка засевают одну колбу, далее 3 — 5 % жидкой культуры, полученной в ней, засевается бутыль. Выращивают 48 — 96 ч. Выращенную культуру охлаждают до 10 — 15 РС и используют для инокуляции торфа.

B. Подготовка торфа. Для производства ризоторфииа „спользу-
ют преимущественно кислые или слабокислые торфа (рН 3,0 — 6,0),
предпочтительно древесно-осоковые и осоковые. Их очищают, высу­
шивают (до влажности 25 — 30 %), размалывают (диаметр частиц —
0,1 мм), загружают в смеситель, увлажняют (до 35 — 40 % Н20),
прибавляют мел (до рН 6,8 - 7,0), перемешивают и фасуют в пакеты
по 150 — 160 г, запаивают.

Г. Стерилизация. Облучение торфа гамма-излучением дозой 2,5 Мрад

обеспечивает практически полную стерильность субстрата-носителя. >

Д. Инокуляция и хранение препарата. В стерильный пакет с тор-


фом вносят жидкий инокулюм клубеньковых бактерий. До инокуля­ции в жидкую культуру вводятся дополнительно стерильные раство­ры углеводов. Ииокулированные пакеты загружают во вращающийся барабан на 3 — 5 мин для перемешивания торфа с жидким ииокулю-мом. Хранят при 5 — 15 °С (до б мес).

Применение ризоторфина происходит таким образом:

1) осуществляется предпосевная обработка семян бобовых в день посева (200 г/га на норму семян);

2) его суспендируют в соответствующем количестве воды, и этой жидкостью обрабатывают семена;

3) суспензия бактерий вносится глубже расположения высевае­мых семян.

Получение азотобактерина

В богатых органическим веществом, хорошо дренированных и увлажненных почвах значительное место занимают свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы. Большой интерес вызывают ассоциативные Azospirillum, обитающие в ризоплаие и гистосфере корней. Фиксация азота в значимых величинах имеется в ассоци­ации азоспирилл с С4-растениями - кукурузой, сахарным тростни­ком, просом. Во Вьетнаме и некоторых других южных странах в каче­стве зеленого удобрения используют водный папоротник — азоллу, — в полостях листьев которого обитает азотфиксирующая цианобакте-рия Anabaena azollae. Его выращивают в особых прудах и вывозят на рисовые поля. Ведется изучение свободноживущих азотфиксиру-ющих цианобактерий в целях их использования для обогащения почв соединениями азота. Особое место среди них занимает азотобактер. При выращивании овощных культур — салата, томатов, огурцов — отмечалось благотворное влияние жидкой культуры этого азотфикса-тора на урожайность. Им обрабатывали корни рассады. Увеличение урожая было связано с образованием биологически активных веществ этими бактериями — антибиотиков, стимуляторов роста, витаминов. Вклад же в азотфиксацию был невелик. Однако в настоящее время исследуется возможность модификации Azotobacter с целью произ­водства биологического удобрения азотобактерина.

Технология получения сухого азотобактерина.Азотобактерин — бактериальное удобрение, приготовленное на основе культуры сво-бодноживущего почвенного микроорганизма Azotobacter chroococcum, способного фиксировать до 20 мг атмосферного азота на 1 г использо­ванного сахара. Более того, внесенные в качестве удобрения бактерии выделяют в почву биологически активные вещества (никотиновую и пантотеновую кислоты, пиридоксин, биотин, гетероауксин, гибберелин и др.), стимулирующие прорастание и развитие растений, а продуци­руемые ими фунгицидные-вещества из группы анисомицина угнетают


развитие некоторых нежелательных микроскопических грибов в ри­зосфере растения.

Все виды азотобактера — строгие аэробы. Микроорганизмы осо­бенно чувствительны к наличию в среде фосфора в виде органических и неорганических соединений и развиваются при высоком содержа­нии его в питательной среде. Недостаток этого элемента замедляет развитие бактерий и снижает азотфиксирующую способность. Мно­гие виды азотобактера фиксируют азот только в среде, обедненной связанным азотом или вовсе лишенной его. Эта способность культу­ры подавляется аммиаком, стимулирующее воздействие на нее оказы­вают соединения молибдена (иногда ванадия).

Установлено, что при фиксации азота процесс его восстановления протекает целиком на одном и том же синтезируемом азотобактером ферментном комплексе, и лишь конечный продукт (аммиак) отделя­ется от фермента. Ответственная за фиксацию иитрогеназная систе­ма представляет собой мультиферментный комплекс, содержащий не связанное с гемом железо, молибден и SH-группы.

Микробиологическая промышленность выпускает несколько ви­дов азотобактерина: сухой, почвенный и торфяной.

Технология получения его в сухом виде имеет много общего с производством сухого нитрагина, поэтому будут рассмотрены только наиболее существенные их отличия.

Азотобактерин сухой представляет собой активную культуру вы­сушенных клеток азотобактера с наполнителем, в 1 г которого должно содержаться не менее 0,5 млрд жизнеспособных клеток. Культуру микроорганизма получают методом глубинного культивирования на среде, содержащей все те же компоненты, что и при выращивании кле­ток Rhizobium. Дополнительно вводят сульфаты железа и марганца, а также сложную соль молибденовой кислоты. Значение рН среды куль­тивирования составляет 5,7 — 6,5, аэрация — 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 мин.

Процесс ферментации проводят до начала стационарной фазы ро­ста культуры, так как во время нее биологически активные вещества выделяются из клетки и остаются в культуральной жидкости. При этом существует опасность, что с их выходом клетки могут утратить способность фиксировать атмосферный азот после внесения в почву.

Биологически активные вещества полностью или частично могут теряться и в процессе высушивания клеток, однако оставшиеся жизне­способными клетки после выведения азотобактера из анабиоза вос­станавливают способность к их продуцированию. Высушенную куль­туру стандартизуют путем добавок необходимого количества напол­нителя и фасуют в полиэтиленовые пакеты по 0,4 — 2 кг, которые герметизируют и хранят при температуре не выше 15 °С в течение не более 3 мес.