Количественное определение кумаринов

При количественном определении кумаринов учитывается то или иное специфическое свойство кумарина. Способность лактонного кольца кумарина к обратимому размыканию и замыканию в зависимости от pH среды используется в гравиметрическом методе определения суммы кумаринов в растительном сырье. Специфическое отношение кумаринов к щелочи лежит в основе метода нейтрализации (обратное титрование), которое применяется как для определения суммы кумаринов, так и для индивидуальных компонентов. Избыток щелочи оттитровывают хлористоводородной или серной кислотой. Недостатком метода является получение заниженных результатов, что объясняется преждевременным замыканием лактонного кольца при обратном титровании, поэтому было рекомендовано перед титрованием переводить соли кумариновой кислоты (ненасыщенная цис-оксикислота) кипячением с раствором гидроксида натрия в присутствии оксида ртути (II) в кумаровую кислоты (трансформа).

Полярографический метод получил широкое применение в анализе кумаринов. Установлено, что восстановление на ртутно-капельном электроде происходит в α-3, 4. Полярографический метод в качестве официального используется для анализа препарата бероксана и его таблеток по 0,01 и 0,25 г или 0,5% раствора.Описано применение полярографии для анализа псоралена в плодах псоралеи костянковой и для контроля его производства.

Способность кумаринов давать устойчивые красно-оранжевые и красно-пурпурные растворы с диазотированным сульфаниламидом в щелочной среде используется в колориметрических методах количественного определения суммы кумаринов и индивидуальных компонентов. Для проведения реакции азосочетания к подщелоченномк (1% раствор карбоната натрия или 5% раствор гидроксида натрия) спиртовому раствору производного кумарина прибавляют определенное количество соли диазония. В качестве реагентов применяют диазотированный п-нитроанилин, сульфаниловую кислоту, сульфиниламид.

Флуоресценция при УФ возбуждении в видимой области лежит в основе флуориметрических методов количественного определения кумаринов. Флюоресценция этих соединений усиливается в присутствии щелочи. Количественный флюоресцентный анализ их не получил широкого применения, хотя и отмечается его высокая чувствительность. Это объясняется тем, чтоинтенсивность флюоресценции не всегда пропорциональна концентации.

Для количественного определения кумаринов применяются спектрофотометрические методы, где учитывается изменение оптической плотности растворов кумаринов при длине волны максимума поглощения в УФ области спектра того или иного кумарина в зависимости от концентрации на основе удельных показателей поглощения. Колориметрическим, флуориметрическим и спектрофотометрическим методам чаще всего предшествует хроматографическое разделение кумаринов на бумаге и в тонком слое сорбента, поэтому эти называются хромато-оптическими методами.

Многообразие методов количественного определения в сырье позволяет провести правильный выбор метода для анализа растительного сырья, учитывая структуру природных кумаринов.

На кафедре фармакогнозии и ботаники ИГМУ разработана методика фотоколориметрического количественного определения суммы кумаринов в растительном сырье.

Методика фотоколориметрического определения суммы кумаринов О.П. Прокопенко основана на экстракции растительного материала 10% этанолом, с последующей очисткой от сопутствующих фенольных соединений свинца ацетатом основным, экстракции кумаринов хлороформом, его отгонке, на реакции с диазотированной сульфаниловой кислотой в щелочной среде.

Нами установлено, что кумарины рододендронов полностью не извлекаются 10%-ным этиловым спиртом, полнота экстракции достигается 70-90%-ным этанолом, при усовершенствовании методики нами в дальнейшем использован 70%-ный этанол.

В известной методике измерение оптической плотности анализируемого раствора проводят с раствором сравнения - этиловым спиртом. В предлагаемой методике при измерении оптической плотности анализируемого раствора используется дифференциальная фотометрия – раствором сравнения служит раствор суммы кумаринов без реактива, что позволяет уменьшить влияние сопутствующих окрашенных соединений на результат и точность определения.

Исследуемые виды рододендронов содержат от 4 до 5 кумаринов, для всех рододендронов характерно присутствие эскулетина, поэтому расчет процентного содержания суммы кумаринов предлагается проводить в пересчете на эскулетин.

Методика: 0,5000 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу на 100 мл, добавляют 50 мл 70%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут, извлечение фильтруют в колбу на 200 мл, фильтр промывают 2 раза горячим 70%-ным этанолом по 10 мл. Затем в колбу добавляют 2 мл 10%-ного раствора свинца ацетата основного и кипятят 3 минуты, горячее извлечение фильтруют через бумажный фильтр, вложенный в воронку диаметром 7 см. Колбу и фильтр промывают 3 раза горячим 70%-ным этанолом по 20 мл.

К фильтрату добавляют 1 г натрия фосфата однозамещенного и кипятят 3 минуты. Горячий раствор фильтруют через бумажный фильтр в колбу со шлифом на 300 мл, фильтр промывают 70%-ным этанолом 3 раза по 20 мл, спирт отгоняют на водяной бане, водный остаток переносят в делительную воронку и обрабатывают 25 мл хлороформа 4 раза. Хлороформный слой каждый раз отделяют и фильтруют через 5 г безводного натрия сульфата, помещенного на фильтр, в сухую колбу. Хлороформ отгоняют до сухого остатка, к нему прибавляют 7 мл 96% этанола, спиртовой раствор переносят в мерную колбу на 50 мл, колбу споласкивают 5 мл 96% этанола и переносят в ту же мерную колбу. Затем добавляют 10 мл 0, 1 М раствора NaOH, нагревают на водяной бане 5 минут и доводят до метки 0, 1 М раствором NaOH (раствор А).

Приготовление разведений: в две пробирки помещают по 0,5 мл раствора А, затем в первую добавляют 6,5 мл 0,1 М раствора NaOH (раствор сравнения), во вторую 1 мл свежеприготовленного диазореактива и 5,5 мл 0,1 М раствора NaOH. Измерение оптической плотности проводят через 20 минут на КФК- 2МП при длине волны 490 нм.

Расчетная формула: X (%) = = , где

V₁– объем общий, равный 50 мл; V₂- объем разбавления, равный 7 мл;

V₃- объем взятый для разбавления, равный 1 мл; c - содержание эскулетина в 1 мл колориметрируемого раствора, найденное по калибровочному графику в граммах; W – потеря в массе при высушивании сырья в процентах; m – масса сырья в граммах.

Для построения калибровочного графика использовали РСО эскулетина, выпущенный фирмой «Chemapol» Prague Czechoslovakia, для которого провели дополнительную очистку методом двойной перекристаллизации.

Точную навеску 0,5000 г эскулетина растворяли в 50 мл 96% этанола и готовили разведения в соответствии с таблицей.

Данные для построения калибровочного графика по эскулетину

№	1% раствора эскулетина, в мл	Диазо-реактив, в мл	0, 1 М р-р NaOH, в мл	96% этанола,в мл	Концентрация эскулетина в г/мл	Оптическая плотность
	0,1			2,9	1·10^-5	0,164
	0,2			2,8	2·10^-5	0,219
	0,3			2,7	3·10^-5	0,274
	0,4			2,6	4·10^-5	0,329
	0,5			2,5	5·10^-5	0,519
	0,6			2,4	6·10^-5	0,686
	0,7			2,3	7·10^-5	0,799
	0,8			2,2	8·10^-5	0,866
	0,9			2,1	9·10^-5	0,955
	1,0			2,0	10·10^-5	1,088

В полученных растворах через 20 минут определяли оптическую плотность на приборе КФК-2МП при длине волны 490 нм и строили калибровочный график (рис. ). Коэффициент корреляции для калибровочного графика r=0,985. В аналитической химии в большинстве случаев используют линейные зависимости с коэффициентом корреляции /r/≥0,98.

Рис. Калибровочный график для количественного определения кумаринов в пересчете на эскулетин.

ФЛАВОНОИДЫ

Флавоноиды(от лат. flavus— желтый, лат. суф. — оп-,греч. eidos- вид) - фенольные соединения, содержащие в своей структуре фрагмент дифенилпропана (С₆-С₃-С₆) и представляющие собой чаще всего производные 2-фенилхромана (флаван) или 2-фенилхромона (флавон). Термин «флавоноид» был предложен в 1949 году английским ученым Гейссманом более века спустя после выделения первого флавоноида кверцетина (Quercus) не только для флавонов — веществ желтого цвета, но и для других соединений флавоноидной природы, имеющих иную окраску — белую или бесцветную (флаваноны), оранжевую (ауроны,халконы),красную, малиновую, синюю (антоцианы).

Классификация флавоноидов

Химическая классификация флавоноидов основана на трех основных признаках:

· степень окисленности кольца С или пропанового фрагмента;

· величина гетероцикла (С);

· положение бокового фенила.

Флавоноиды целесообразно разделять на следующие группы:

Катехины

Катехин: листья чая китайского и др.

Катехины (флаван-3-олы)- бесцветные соединения, которые, являясь наиболее восстановленными флавоноидами, легко поддаются окислению, в результате чего приобретают розовую или красную окраску. Характерным примером может служить чай, различный цвет которого (черный, красный, желтый) обусловлен степенью окисленности катехинов.

Катехин — оптически активное вещество, поэтому может существовать в виде 4 изомеров, отличающихся направлением и величиной угла вращения: D-катехин, L-катехин, D-эпикатехин, L-эпикатехин. Изомеры отличаются друг от друга не только физическими свойствами (температура плавления, удельное вращение и др.), но и биологическим действием. Например, L-эпикатехин, содержащийся в чае, обладает большей P-витаминной активностью, чем другие изомеры катехина.

2. Лейкоантоцианидины

Лейкоантоцианидин: листья чая китайского и др.

Лейкоантоцианидины, или проантоцианидины (флаван-3,4-диолы), как и катехины, — бесцветные соединения. Лейкоантоцианидины при нагревании с кислотами превращаются в антоцианидины и приобретают красную окраску (цианидин). Обычно лейкоантоцианидины существуют в свободном виде. В качестве типичного примера этой группы соединений можно привести лейкоцианидин, имеющий строение 3,4,5,7,3',4'-гексагидроксифлавана.

Антоцианидины

Цианидин: плоды рябины черноплодной

Особенностью строения антоцианидинов является наличие свободной валентности у кислорода в пирановом кольце. Благодаря положительному заряду антоцианидины в кислом растворе ведут себя как катионы и образуют соли с кислотами, в щелочном растворе — как анионы и образуют соли с основаниями. В зависимости от рН среды изменяется и окраска (см. физико-химические свойства).

Антоцианидины обычно встречаются в природе в виде гликозидов — антоцианов, причем наиболее типичным и распространенным является цианидин (3, 5, 7, 3^', 4'-пентагидроксиантоцианидин). В растениях встречаются также и другие антоцианы - дельфинидин(3, 5, 7, 3',4', 5'-гексагидроксиантоцианидин), мальвидин (3, 5, 7, 4¹-тетрагидрокси- 3', 5'-диметоксиантоцианидин) (черника) и др.

Дельфинидин Мальвидин

4.Флаваноны

Пиноцембрин: почки тополя

Флаваноны(от лат. flavus — желтый, лат. суф. -an-, -on-) - группа флавоноидов, содержащих один ассиметрический атом углерода (при С-2), УФ спектры которых имеют один интенсивный максимум поглощения при 289 нм. Флаваноны не содержат хромофоров, поэтому, как правило, не имеют окраски. В лекарственных растениях наиболее распространены пиноцембрин, пиностробин (почки тополя), нарингенин (цветки бессмертника песчаного), эриодиктиол и гесперетин (плоды лимона).

Нарингенин: R=R₂₌H; R₁₌OH Пиноцембрин: R=H

Эриодиктиол: R=H; R₁₌R₂₌OH Пиностробин: R=CH₃

Гесперетин: R=H; R₁₌OH; R₂₌OCH₃

5.Флаванонолы

Таксифолин (дигидрокверцетин): лиственница сибирская

Флаванонолы(от лат.flavus— желтый) — группа флавоноидов, содержащих два ассиметрических атома углерода (при С-2 и С-3), УФ спектры которых имеют один интенсивный максимум поглощения при 289 нм. Флаванонолы не содержат в себе хромофоров, поэтому, как правило, не имеют окраски.

В лекарственных растениях наиболее распространены дигидрокемпферол (листья чая китайского), пинобанксин (древесины сосны обыкновенной), почки тополя), таксифолин (древесина лиственницы сибирской).

Пинобанксин: R=R₁₌R₂₌H

Дигидрокемпферол: R=R₁₌H; R₁₌OH

Таксифоллин: R=H;R₁=R_{2 =}OH

6.Флавоны

Лютеолин: цветки пижмы

Флавоны(от лат. flavus) - широко распространенная группа флавоноидов, имеющих, как правило, светло-желтую, желтую или желто-зеленую окраску. Для УФ спектров флавонов характерны два максимума поглощения при - 270 нм (коротковолновый максимум) и при-340-350 нм (длинноволновый максимум), что успешно используется в методиках количественного определения веществ с применением спектрофотометрического метода. Наиболее распространенными агликонами флавонов являются хризин, апигенин, акацетин, лютеолин, диосметин, хризоериол, диуретин и трицин.

Хризин:R=R₁₌R₂₌H; Апигенин:R=R₂₌H; R₁₌OH

Акацетин:R=R₂₌H; R₁₌OCH₃

Лютеолин:R=H; R₁₌R₂₌OH

Хризоериол:R=H; R₁₌OH; R₂₌OCH₃

Диосметин:R=H; R₂₌OH; R₁₌OCH₃

Трицин:R₁₌OH; R=R₂₌OCH₃

Флавонолы

Кверцетин: цветки софоры японской и др.

Флавонолы(от лат. flavus—желтый) — широко распространенная группа флавоноидов, имеющих, как правило, желтую или желто-зеленую окраску. Для УФ спектров флавонолов характерны два максимума поглощения при - 260 нм (коротковолновый максимум) и при - 360-370 нм (длинноволновый максимум), что успешно используется в методиках количественного определения веществ с использованием спектрофотометрического метода. Наиболее распространенными агликонами флавонолов являются галангин, кемпферол, кверцетин, изорамнетин, мирицетин, гербацетин.

Галангин:R=R₁₌R₂₌R₃₌H

Кемпферол:R=R₁₌R₃₌H; R₂₌OH

Кверцетин:R=R₁₌H; R₂₌R₃₌OH

Изорамнетин:R=R₁₌H; R₂₌OH; R₃₌OCH₃

Мирицетин:R=H; R₁₌R₂₌R₃₌OH

Гербацетин:R₁₌R₃₌H; R=R₂₌OH

8.Изофлавоны

Формононетин: корни солодки, стальника.

Изофлавоны отличаются от других групп флавоноидов положением бокового фенильного кольца, которое находится не у С-2, а у С-3.

Халконы

Ликуразид:корни солодки Изосалипурпозид: цветки бессмертника песчаного

Халконы— флавоноиды с раскрытым у-пироновым кольцом (С). В кислой среде халконы превращаются в соответствующие флаваноны. Типичными халконами являются ликуразид (агликон — изоликвиритигенин) и изосалипурпозид.

Дигидрохалконы

2',6'-дигидрокси-4'-метоксидигидрохалкон: почки тополя

Ауроны

Сульфуретин: трава череды трехраздельной

Флаволигнаны

Силибин: плоды расторопши пятнистой

Флаволигнаны, флаванолигнаны, флавонолигнаны— продукты окислительного сочетания флавоноидов и фенилпропаноидов, чаще всего коричных спиртов. Силибин является первым флаволигнаном, веделенным из растений в 1964 году немецкими учеными (Wagner H., Hansel R. и др.) из плодов расторопщи пятнистой. Химическое строение силибина изучалось в течение более 20 лет, в результате чего данное соединение было отнесено к новому классу природных веществ — флавонолигнанам. Впоследствии этот класс Куркиным В.А., Запесочной Г.Г. был назван флаволигнанами.

13. Бифлавоноиды

Бифлавоноиды различаются между собой различным сочетанием двух молекул агликонов, структурой сочетающихся флавоноидов и характером связи. Наиболее типичными бифлавоноидами являются компоненты листьев чая (димеры катехина), гинкго двулопастного (аментофлавон, гинкгетин), травы зверобоя продырявленного (биапигенин).

Катехин-6',8-димер

Катехин-4,8-димер

Аментофлавон: R=H

Гинкгетин:R=CH₃