КОНТРОЛЬ ЗА РАБОТОЙ АВТОКЛАВА 2 страница
Задание № 1: Изучить способы стерилизации.
Задание № 2: Ознакомиться с устройством приборов и аппаратов применяемых в лабо- раторной практике. Освоить правила обращения с автоклавом.
Методика выполнения:
Задание № 1.
Одним из основных условий работы в лаборатории является отсутствие на инструментах, посуде и в питательных средах микроорганизмов, уничтожение которых достигается стерилизацией (обеспложиванием). В лабораторной практике стерилизация осуществляется: 1) прокаливанием на пламени; 2) кипячением; 3) сухим жаром (в сушильном шкафу); 4) водяным паром (в текучепаровом аппарате, автоклаве); 5) различными химическими веществами; 6) механическими способами (фильтрация).
Задание № 2.
Лабораторная аппаратура и правила пользования ею. Микроскопы: световые, люминесцентные, электронные.
Л ю м и н е с ц е н т н ы е м и к р о с к о п ы используют для изучения объектов, обладающих собственным свечением, или объектов с вторичным свечением, возникающим после обработки их специальными красками – флуорохромами (акридин, аурамин, флуоресцеин и др.). Изучают также люминесцирующие антитела – специфические гамма-глобулины, выделенные из гипериммунных сывороток, соединенные с красителями. При окрашивание мазков такие меченые антитела адсорбируются при исследовании в люминесцентном микроскопе в виде яркого свечения.
 |
|
А в т о к л а в (рис.2) служит для стерилизации водяным паром под давлением. Он представляет собой массивный металлический котел 12, одетый снаружи кожухом 13 и снабженный герметически закрывающейся крышкой 15. Внутри наружного котла находится другой котел меньшего диаметра 14. Между ними есть свободное пространство, куда поступает пар из парообразователя 8 через патрубок 17. Парообразователь имеет воронку 1 с кранами и водомерным стеклом 9, по которому определяют уровень воды. При подогревании автоклава образуется пар, который через отверстие в днище внутреннего котла 11 попадает во внутреннее пространство, где располагаются стерилизуемые предметы. Когда закрывают выпускной кран 16, то образующийся пар поднимает давление и температуру. За повышением давления следят по показанию манометра 2. Во избежание разрыва автоклава устроен предохранительный клапан 10, автоматически открывающийся или закрывающийся в зависимости от силы давления в аппаратуре. В нижней части автоклава устроен кран 16 для спуска пара и воды после работы.
К работе с автоклавом допускают только лиц, изучивших инструкцию и сдавших экзамен по технике безопасности. Работа с автоклавом требует строгого выполнения установленных правил и определенной последовательности: 1) наливают воду через воронку не менее чем на 2/3 водомерного стекла; 2) загружают в автоклав стерилизуемые предметы; 3) плотно завинчивают крышку –15 и открывают выпускной кран 16; 4) включают нагревательное устройство – ручку 5 в положение «Включено», ручку 6 – в положение «Нагрев»; 5) при закипании воды через кран выходит влажный пар. Кран можно закрывать только тогда, когда начнет выходить сухой пар со свистом сильной непрерывной струей (через 3 - 5 мин); 6) закрывают выпускной кран 16 и наблюдают за повышением давления по манометру 2. При достижении требуемого уровня замечают время и ручку переключателя ставят в положении «Стерилизация»; 7) по окончании срока стерилизации ставят ручку выключателя 5 в положение «0», прекращая нагрев автоклава; 8) следят за падением давления по манометру и, когда его стрелка вернется в положение «0», открывают кран 16 и выпускают пар. Открывают крышку автоклава, дают остыть и вынимают простерилизованные предметы.
Контроль за работой автоклава осуществляется с помощью веществ, которые плавятся при определенной температуре (бензонафтол при 110*С, серный цвет при 115*С, бензойная кислота при 120*С). В пробирку с одним из этих веществ добавляют фуксин или сафранин, плотно закрывают или запаивают и помещают в автоклав. Если температура достигает уровня, соответствующего температуре плавления данного вещества, то последняя расплавится и окрасится добавленной краской.
В автоклаве стерилизуют предметы, которые не портятся и не изменяются при температуре выше 100*С. Автоклав может быть использован и как текучепаровой аппарат, если на время стерилизации не закрывать выпускной кран.
Т е к у ч е п а р о в о й а п п а р а т (а п п а р а т К о х а) – металлический цилиндр, обшитый с наружи теплоизоляционным материалом, внутри разделенный на нижнюю и верхнюю части. В нижнюю часть наливают воду, на подставку в верхней части кладут предметы для стерилизации. Когда температура достигнет 100*С, а пар начнет выходить непрерывной струей, замечают время и продолжают стерилизацию в течение 25 – 60мин. При этом погибают только вегетативные формы микробов. Стерилизацию сопровождающего материала осуществляют дробно – 3 дня подряд при 100*С в течение 30мин, чтобы споры проросли в вегетативные формы, которые погибнут при повторной обработке. В текучепаровом аппарате стерилизуют предметы, которые портятся или изменяются при температуре выше 100*С (например, среды, содержащие углеводы).
С у ш и л ь н ы й ш к а ф (п е ч ь П а с т е р а) применяют для стерилизации сухим жаром. Это металлический ящик с двойными стенками, обложенный внутри асбестом. Нагрев проводят электричеством или газовой горелкой. Стерилизуют в сушильном шкафу пробирки, пастеровские пипетки, бактериологические чашки, колбы и др. стеклянную посуду. Стеклянные предметы заворачивают в бумагу. Время обработки 2ч при 100*С или 1ч при температуре 160*С. На достаточную степень стерилизации указывает пожелтение ватных пробок и бумаги.
В о д я н ы е б а н и – ванночки, подогреваемые электричеством или газовыми горелками. В них обрабатывают вещества, не выдерживающие высокой температуры. Нагревание осуществляют при 56 – 58*С в течение 1 – 2ч. Для полной стерилизации нагревают по одному часу в течение 3 суток подряд при указанной температуре.
Ф и л ь т р о в а л ь н ы е п р и б о р ы используют для освобождения жидкости от бактерий и грибов, а также для получения вирусов в чистом виде, т. к. они в отличии от бактерий проходят бактериальные фильтры. Для фильтрации употребляют асбестоцеллюлозные и мембранные фильтры с определенными размерами пор. Фильтры закрепляют между металлическими пластинками в фильтродержателях (системы Зейтца, Сальникова и др.). Жидкости фильтруют под повышенным или пониженным давлением, которое создают с помощью насосов. Перед работой фильтры в смонтированном виде стерилизуют, а после работы фильтры уничтожают, металлические части стерилизуют автоклавированием.
Ц е н т р и ф у г и - приборы, основанные на действии центробежной силы, с их помощью определяют плотные частицы от жидкости или разделяют жидкости, различные по плотности. Бывают ручными или электрическими, состоящими из электромотора, оси, на которой укреплены ротор или металлические гильзы для центробежных стаканов или пробирок. Количество оборотов регулируют с помощью реостата. Перед началом надо уравновесить центрифужные пробирки на центрифужных весах добавлением воды или той жидкости, которую центрифугируют (можно кусочками ваты или бумаги, которые вкладывают в стаканчики). Стаканчики с пробирками вставляют в гнезда, расположенные друг против друга. Крышку плотно закрывают и фиксируют винтами или зажимами. Включают ток и постепенно увеличивают число оборотов. Открывать крышку центрифуги можно только после ее полной остановки.
Х о л о д и л ь н и к и используют для длительного хранения микробных культур, биопрепаратов, а в некоторых случаях – исследуемого патологического материала. Бактериальные культуры хранят при температуре 4*С, вируссодержащий материал – в замороженном виде. Температура регулируется специальным устройством. Внутрь холодильника помещают термометр, его показания ежедневно вносят в лист контроля работы прибора.
Приборы для получения дистиллированной воды. Дистиллиационный аппарат можно изготовить из колбы (Вюрца), холодильника (Либиха) и приемника воды. Колбу заполняют на 2/3 водой, плотно пригоняют к пробке. Подогревают на электроплитке (через асбестовую сетку) или на водяной бане. Чтобы избежать бурного кипения воды, на дно колбы кладут кусочки неглазированного фарфора или несколько стеклянных трубок, запаянных с одного конца. Для получения большого количества дистиллированной воды пользуются дистилляторами различных систем, выпускаемыми промышленностью.
В лаборатории ветеринарной медицины,кроме перечисленной аппаратуры и оборудования имеются термостаты, анаэростаты для культивирования микроорганизмов, лабораторная посуда, инструменты.
Отчёт
Задание №1
| Н а з в а н и е | М е т о д ы |
| С Т Е Р И Л И З А Ц И Я (обеспложивание) | |
Задание №2
| П р и б о р ы | Н а з н а ч е н и е , t; экспозиция |
Задание №2
КОНТРОЛЬ ЗА РАБОТОЙ АВТОКЛАВА
| Вещества | t, плавление |
Вывод:_________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Дата ____________________ Подпись преподавателя __________________________________
Лабораторная работа № 4.
Тема: Ознакомление со схемами постановки серологических реакций.
Цель занятия: Изучение методики постановки реакций иммунитета.
Литература: И.А. Бакулов. Практикум по эпизоотологии с микробиологией с.52 – 68.
Задание № 1. Изучить методику постановки реакции преципитации. Оценка результатов
реакции.
Задание № 2. Изучить методику постановки реакции агглютинации. Оценка результатов
реакции.
Задание № 3. Изучить методику постановки реакции связывания комплемента. Оценка
результатов реакции.
Методика выполнения:
Задание № 1.
Реакция преципитации (РП).Исследуют робы кожи на сибирскую язву. Пробы предварительно простерилизованы в автоклаве.
К о м п о н е н т ы р е а к ц и и : кусочек кожи измельчают. 1 г полученной массы помещают в пробирку, заливают 10 мл физраствора и 30 – 40 мин кипятят в водяной бане ( горячий способ постановки реакции ). Другой вариант: 1 г измельченной кожи растирают в ступке с песком, заливают 0,3 %- ным карболизированным физраствором ( 1: 10 ) и 16 – 18 ч настаивают при комнатной температуре ( холодный способ ). Экстракт, который может содержать сибиреязвенный антиген ( преципитиноген ), фильтруют через асбестовую вату до полной прозрачности. Второй компонет – биофабричная преципитирующая сибиреязвенная сыворотка. Перед постановкой реакции ее фильтруют.
П о с т н о в к а р е а к ц и и . Мерной пипеткой наливают в специальные преципитационные пробирки по 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой осторожно по стенке пробирки наслаивают на сыворотку исследуемый экстракт в таком же количестве (метод наслаивания). При использовании метода подслаивания в пробирки наливают исследуемый экстракт, а затем, опустив пастеровскую пипетку на дно пробирки, подслаивают под нее преципитирующую сыворотку.
Реакция считается положительной, если в течение первых 15 мин с момента ее постановки на границе соприкосновения экстракта и сыворотки образуется серовато-белое кольцо. Если это кольцо недостаточно резко выражено, реакцию оценивают как сомнительную, а при отсутствии кольца – как отрицательную.
Непосредственно перед постановкой реакции ставят контроли с ее компонентами: 1) сибиреязвенный антиген (биофабричный) + преципитирующая сыворотка – реакция должна быть положительной; 2) сибиреязвенный антиген + нормальная сыворотка лошади – реакция должна быть отрицательной; 3) физраствор + преципитирующая сыворотка – реакция должна быть отрицательной.
Задание № 2.
Р е а к ц и я а г г л ю т и н а ц и и (РА). Исследуют сыворотки крови животных на бруцеллез.
К о м п о н е н т ы р е а к ц и и: пробы сывороток крови, единый бруцеллезный антиген для роз бенгал пробы, позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки, фенолизированный (0,5%-ный) физраствор.
Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным розбенгал антигеном (РБП). Реакцию проводят на чистых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18 – 30*С. С помощью шприца-полуавтомата или микропипетки вносят на дно лунок до 0,03мл исследуемых сывороток. Затем в каждую лунку добавляют по 0.03мл цветного антигена. При исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов и северных оленей достаточно 0,015мл антигена. Антиген и сыворотки тщательно смешивают, распределяя полученную смесь по всей поверхности лунки. Пластинку осторожно покачивают. Реакцию учитывают в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном. При наличии выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена, проявляющейся образованием розовых хлопьев, реакцию считают положительной, а при отсутствии агглютинации (смесь остается равномерно окрашенной) – отрицательной. Если кровь была доставлена из благополучных хозяйств, все сыворотки с положительной РБП не позже чем на следующий день исследуют в РА и РСК. Окончательная диагностическая оценка сомнительна только при положительной РБП и отрицательных РА и РСК. В остальных случаях она положительная. По аналогичной схеме оценивают результаты исследований сывороток крови КРС, буйволов, лошадей и верблюдов из неблагополучных хозяйств. Но овец, коз, свиней и северных оленей из таких хозяйств признают больными бруцеллезом при положительных результатах РБП без дополнительных исследований.
Перед постановкой РБП ставят контроль антигена с негативной и позитивной бруцеллезными сыворотками и контроль антигена на спонтанную агглютинацию: к 0,03мл антигена добавляют 0,03мл физраствора.
Классический (пробирочный) метод РА.Реакцию с сыворотками крови КРС проводят в объеме 1 мл в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400. Контроли: с негативной сывороткой в тех же разведениях и с позитивной бруцеллезной сывороткой до ёё предельного титра.
Для исследования каждой сыворотки требуется 5 пробирок. В первую из них вносят 0,1 мл сыворотки и добавляют 2,4 мл физраствора (основное разведение 1:25). В третью, четвёртую и пятую пробирки вливают по 0,5 мл физраствора. Затем из первой пробирки переносят во второю и третью по 0,5 мл основного разведения сыворотки. После смешивания 0,5 мл содержимого третьей пробирки переносят в четвертую и так же – из четвертой в пятую, после чего из пятой пробирки удаляют 0,5 мл полученной смеси. Затем во вторую, третью, четвёртую и пятую пробирки добавляют по 0,5 мл антигена, разбавленного физраствором в соотношении 1:10. Так получают требуемые разведения сыворотки. В первую пробирку антиген не вносят ( контроль качества сыворотки). Сыворотки разливают микропипеткой (с грушей), а при массовых исследованиях – групповыми дозаторами Флорентийского.
Штатив с пробирками осторожно встряхивают, помещают на 16 – 20 ч в термостат при 37 –38*С, затем в течение 1 ч выдерживают при комнатной температуре и проводят учёт реакции.
Учёт начинают с контроля. Ход реакции нормален, если в контроле с негативной сывороткой получен отрицательный результат, а с позитивной бруцеллёзной сывороткой – положительный. Результаты определяют в крестах. Четыре креста (++++ ) – полное просветление жидкости и наличие ясно выраженного осадка в виде зонтика. При встряхивании пробирки зонтик разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остаётся прозрачной (100% агглютинации ).Три креста (+++ )-неполное просветвление жидкости и хорошо выраженный зонтик (75% агглютинации). Два крета (++) – слабое просветвление жидкости и умеренно выраженный зонтик (50% агглютинации). Один крест (+) – едва заметное просветвление жидкости, зонтик выражен слабо (25% агглютинации). Минус (-) - просветвления жидкости нет, зонтик не образовался, на дне пробирки виден осадок в виде точки, при лёгком встряхивании пробирки образуется равномерная взвесь.
За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на два креста. У КРС бруцеллёз считают установленным при положительной РА в титре 1:200 и выше, т.е. при наличии в 1 мл сыворотки не менее 200 МЕ антител.
Задание № 3.
Реакция связывания комплемента ( РСК ).С у щ н о с т ь р е а к ц и и. При добавлении к сыворотке, содержащей определённые антитела (в нашем примере – бруцеллёзные), соответствующего антигена, а затем комплемента происходит соединение этих трех компонентов (бактериологическая система). Факт указанного соединения выявляют при внесении в бактериолитическую систему второй, гемолитической системы, состоящей из гемолизина и эритроцитов барана. При отсутствии в исследуемой сыворотке антител к применённому в реакции антигену про изойдёт гемолиз эритроцитов, так как комплемент, не связавшийся в первой системе, соединится с гемолизином во второй, гемолитической системе.
К о м п о н е н т ы р е а к ц и и: испытуемая и контрольные (негативная и позитивная бруцеллезная) сыворотки крови КРС; антиген бруцеллезный, единый для РА, РСК и РДСК в рабочем титре, указанном предприятием-изготовителем; комплемент – свежая, консервированная или сухая сыворотка крови морской свинки; гемолитическая сыворотка (гемолизин) в удвоенном титре, указанном изготовителем; эритроциты барана – 2,5%-ная (от осадка) взвесь в физрастворе; физраствор. В день постановки реакции испытуемую и контрольные сыворотки инактивируют в водяной бане при 60 – 62*С в течение 30мин.
Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в гемолитической и бактериологической системах. Периодически (один раз в 3 месяца и каждую новую серию) титрируют и гемолизин.
Титрование гемолизина. В начале готовят основное разведение гемолизина – 1:100 (0,1мл гемолизина + 9,9мл физраствора). Затем из основного готовят разведения 1:500; 1:1000 и т.д. до 1:4000 по следующей схеме:
Основное разведение Физиологический Получаемое
гемолизина 1:100мл раствор,мл разведение
0,4 1,6 1:500
0,1 0,9 1:1000
0,1 1,4 1:1500
0,1 1,9 1:2000
0,1 2,4 1:2500
0,1 2,9 1:3000
0,1 3,4 1:3500
0,1 3,9 1:4000
В пробирки вносят по 0,2мл каждого разведения гемолизина и добавляют по 0,2мл комплемента в разведении 1:20, по 0,2мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов, по 0,4мл физраствора. Пробирки встряхивают, ставят в водяную баню при 37 – 38*С на 10 мин и затем учитывают результат. Титр гемолизина – его наименьшее количество, необходимое для полного гемолиза в течение 10 мин 0,2мл взвеси эритроцитов в присутствии 0,2мл комплемента, разведенного 1:20. Рабочий титр должен быть в 2 раза выше.
Титрование комплемента в гемолитической системе. Комплемент в разведении 1:20 разливают в пробирки в дозах от 0,02 до 0,2мл с интервалами по 0,02мл. В каждую пробирку добавляют физраствор до объема 0,2мл. Затем во все пробирки вносят по 0,2мл гемолизина в удвоенном титре и по 0.2мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов. Следующий этап – добавление физраствора по 0,4мл. После встряхивания пробирки на 10 мин помещают в водяную баню при з7 – 38*с и учитывают результат. Титр комплемента – его наименьшее количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов.
Титрование комплемента в бактериолитической системе. Оно позволяет окончательно определить дозу комплемента для системы с испытуемой сывороткой и антигеном. Используют инактивированные позитивную бруцеллезную и негативную сыворотки. Их разводят физраствором 1:5 и разливают по 0,2мл: каждую в два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент, разведенный 1:20, в возрастающих дозах: от 0,02 до 0,2мл с интервалом 0,02мл. Недостающее по 0,2мл содержимое пробирок дополняют физраствором. После розлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2мл антигена в рабочем разведении, а во второй ряд – по 0,2мл физраствора. Пробирки встряхивают и на 20 мин ставят в водяную баню. Затем во все пробирки добавляют по 0,4мл гемолитической системы (0,2мл гемолизина в рабочем титре и 0,2мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов) и вновь ставят на 20 мин в водяную баню при 37 – 38*С. После этого учитывают результат. Титр комплемента в бактериолитической системе – его минимальное количество, вызывающее полный гемолиз взвеси эритроцитов в пробирках с негативной сывороткой с антигеном и без него, а также в пробирках с позитивной сывороткой без антигена при задержке гемолиза в пробирках с позитивной сывороткой с антигеном.
Проведение главного опыта. Испытуемую сыворотку исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена ( контроль ). Реакцию проводят в объеме 1 мл – каждый компонент берут в объеме 0,2 мл в установленном рабочем титре ( разведении ). Контроли главного опыта : негативная и позитивная бруцеллёзная сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена; гемолитическая система ( гемолизин и эритроциты по 0,2 мл и 0,6 мл физраствора ).
После розлива компонентов бактериолитической системы ( сыворотка +антиген+комплемент ) пробирки в течение 20 мин выдерживают в водяной бане. Затем разливают компоненты гемолитической системы и вновь на 20 мин помещают пробирки в водяную баню. Результаты реакции учитывают через 3 – 4 ч после извлечения штативов из водяной бани и оценивают в крестах: ++++ - отсутствие гемолиза; +++ - гемолиз 25% эритроцитов; ++ - гемолиз 50% эритроцитов; + - гемолиз 75% эритроцитов; - ( минус ) – полный гемолиз эритроцитов, отсутствие осадка, интенсивное окрашивание жидкости гемоглобином. Реакцию признают положительной при задержке гемолиза на 2 – 4 креста в одном или двух разведениях испытуемой сыворотки и сомнительной – при задержке гемолиза с оценкой в один крест. При получении сомнительного результата сыворотки крови от соответствующих животных через 15 – 30 дней исследуют повторно. Если сомнительная РСК получена дважды, животных считают положительно реагирующими.
Отчёт
Задание №1 РП.
| Постановка реакции (в рисунке) | Учёт реакции |
Задание №2 РА.
| Постановка реакции (в рисунке) | Учёт реакции |
Задание №3 РСК (общая схема)
| Компоненты и этапы постановки РСК | Больное животное | Здоровое животное |
| Ьактериометрическая система | ||
| Геометрическая система | ||
| Результат | ||
| Заключение | ||
Вывод:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________