Доказательство проявления активности аланин-аминотрансферазы (АлАТ) методом бумажной хроматографии

Аланинаминотрансфераза (АлАТ), как и другие аминотрансферазы, участвует во взаимном превращении a-аминокислот и a-кетокислот в цитозоле клетки.

Аланин + a-Кетоглутарат Пируват + Глутамат

Поэтому активность АлАТ можно определить качественно по появлению в реакционной смеси новой аминокислоты, образовавшейся в результате переноса аминогруппы от аланина или глутамата на a-кетоглутарат или пируват соответственно (в зависимости от того в каком направлении проводится реакция).

Цель работы

Методом бумажной хроматографии показать наличие активности АлАТ и определить, какая аминокислота (аланин или глутамат) присутствовала в исходной субстратной смеси, то есть в каком направлении проводилась ферментативная реакция.

Принцип метода.

Поскольку в результате ферментативной реакции образуется новая аминокислота, осуществляют идентификацию исходной и образующейся под действием АлАТ аминокислот методом радиальной бумажной хроматографии (см. работу 1.4.Б «Хроматографическое разделение аминокислот»). Идентификацию проводят после окраски нингидрином по сравнению величин Rf исследуемых АМК со стандартными, которые разделяют одновременно в тех же условиях. Для решения задачи необходимо провести три независимых хроматографических разделения: 1) субстратной смеси (одна аминокислота); 2) субстратной смеси + АлАТ (образуется вторая аминокислота); 3) стандартного раствора аланина и глутамата для идентификации.

Выполнение работы

Берут три диска хроматографической бумаги диаметром 12 см. Простым карандашом сверху обозначают фамилию студента и номер диска. В центре каждого диска обводят круг диаметром 0,3-0,4 см. Микропипеткой в центр дисков наносят реактивы, как указано в таблице.

 

Диски I субстрат II cубстрат + фермент III стандарт
    Реактивы
Субстратная смесь (аминокислота + кетокислота) 2 мкл 2 мкл —
Стандартная смесь (глутамат + аланин) — — 2 мкл
Раствор АлАТ — 2 мкл —
Число окрашенных зон и характер окраски      
Rf для каждой зоны аминокислоты      

 

Через 10 минут после нанесения последнего реагента (время инкубации) все три диска подсушивают на воздухе. На каждом диске от края к центру делают ножницами два параллельных разреза (ширина разреза равна диаметру кружочка в центре диска). Вырезанную полоску отгибают перпендикулярно диску так, чтобы линия сгиба проходила через середину зоны нанесения растворов. «Ножку» укорачивают до 2-3 см, и диск помещают между нижней и верхней половинками чашки Петри, содержащей смесь бутанол + уксусная кислота + Н2О в соотношении 5:1:4. Проводят хроматографическое разделение под тягой приблизительно в течение 1 часа. Диски извлекают из хроматографической камеры и обводят фронт растворителя простым карандашом. Высушивают в сушильном шкафу при 100°С, смачивают раствором нингидрина и снова высушивают[§§].

Рассчитывают величину Rf для каждой окрашенной зоны и проводят идентификацию аминокислот. Делают вывод о том, какая аминокислота находилась в субстратной смеси. Затем вырезают сегменты из каждого диска и складывают их вместе рядом, совмещая центральные зоны нанесения вещества.

 

 

Пояснение к рисунку: Ала – аланин Глу – глутаминовая кислота

 

Выводы