Установление принадлежности выделенных культур к роду Streptococcus
Первый день. Идентификация стрептококков начинается с изучения колоний в первичных посевах патологического материала на чашках с 5% кровяным агаром.
По виду гемолиза на кровяном агаре стрептококки делятся на 3 группы.
1.Гемолитические стрептококки (S. haemolyticus), обуславливающие лизис эритроцитов с образованием вокруг колоний прозрачной зоны (полного просветления среды), шириной от десятых долей до нескольких миллиметров. Колонии гемолитических стрептококков бывают: а) мукоидные, диаметром 1,5-2,5 мм, правильной круглой формы, блестящие, напоминающие своим видом капельки росы. Данный вид колоний характерен для содержащих капсулу свежевыделенных штаммов S. pyogenes (группы А); б) шероховатые ("matt" форма), 1,5-2,5 мм в диаметре, круглые колонии, серовато - белого цвета, с характерным, слегка приподнятым центром.
Этот вид колоний также характерен для свежевыделенных, содержащих М-протеин, штаммов; в) гладкие ("glossi" форма), мелкие, 1-1,5 мм в диаметре, колонии сферической формы с ровным краем, с блестящей влажной поверхностью. Этот тип колоний характерен для слабо вирулентных и авирулентных штаммов S. pyogenes, многих штаммов S. agalactiae и некоторых штаммов энтерококков.
2. Зеленящие стрептококки S. viridans, образующие на кровяном агаре альфа - реакцию в виде полупрозрачной, зеленоватого оттенка зоны, обусловленной превращением гемоглобина в метгемоглобин. Зеленящие стрептококки растут в виде мелких, 1,0-1,5 мм в диаметре, колоний серовато - зеленоватого цвета, с гладкой или шероховатой поверхностью. Этот тип колоний характерен для многих стрептококков вегетирующих постоянно на слизистой полости рта (S. salivarius, S. sanguis, S. bovis), для отдельных штаммов S. agalactiae, а также для S. faecalis, S. faecium, A. viridans. Колонии пневмококка на кровяном агаре полупрозрачные, плоские с приподнятым краем и блюдцеобразным центром, вокруг колоний зеленящая зона гемолиза.
R-формы образуют сферические колонии с неровными краями. III тип пневмококка иногда имеет вид серовато - мутных, слизистых колоний до 2 мм в диаметре, склонных к слиянию между собой.
3. Негемолитические стрептококки (S. anhaemolyticus), не реагирующие с эритроцитами и в процессе своего роста не вызывающие изменений кровяного агара.
Гемолитическая активность способствует выявлению патогенных штаммов стрептококка, не являясь, однако, дифференциально - диагностическим признаком их патогенности. Штаммы негемолитических стрептококков, выделенные от человека, практического значения не имеют, т.к., за очень редким исключением, они не связаны с инфекционным процессом.
Из колоний, подозрительных в отношении стрептококка, бактериальной петлей берут небольшое количество материала, делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Микроскопия препаратов на данном этапе исследования предусматривает дифференциацию стрептококков от грамотрицательных гемофильных микроорганизмов, рост которых на кровяном агаре сходен с ростом гемолитических стрептококков.
В препаратах, приготовленных из колоний с плотных питательных сред, стрептококки располагаются парами, короткими цепочками, иногда образуют скопления, напоминающие грозди стафилококков.
Морфологические свойства стрептококков, особенно в первых генерациях, характеризуются выраженным полиморфизмом. Наряду с шарообразными формами в мазках содержатся вытянутые в длину грубые кокки разной величины, даже в пределах одной цепочки. Пневмококки представляют собой ланцетовидные диплококки с заостренными наружными концами, каждая пара кокков или несколько пар заключены в капсулу, образуя цепочки.
При обнаружении стрептококков в препарате оставшийся от микроскопического исследования материал колоний снимают петлей и инокулируют в питательный бульон с сывороткой крупного рогатого скота (10%) или глюкозы (0,2%), или высевают на питательную среду для выделения гемокультур стрептококков. Оптимальная температура культивирования стрептококков – 370 С.
Второй день. Просматривают пробирки с посевами, сделанными накануне. Характер роста стрептококков в жидких питательных средах определяется длиной цепочек. Соответственно этому различают: а) придонно - пристеночный рост с образованием мелкокрошковатого осадка с сохранением полной прозрачности среды. Зернистый рост характерен для видов и штаммов стрептококка, образующих длинные цепочки (S. pyogenes); б) придонный рост в виде пушистого рыхлого осадка, с сохранением полной прозрачности или равномерным более или менее интенсивным помутнением надосадочного слоя бульона (S. pneumoniae). С уменьшением длины цепочек возрастает наклонность к диффузному росту (S. agalactiae, отдельные штаммы вирулентных S. pyogenes, S. faecalis, S. faecium); в) диффузный рост с интенсивным помутнением бульона и образованием небольшого гомогенного осадка (S. faecalis, S. faecium, отдельные штаммы S. agalactiae, единичные штаммы S. pyogenes).
Из содержимого пробирок бактериальной петлей берут небольшое количество материала, делают мазок, окрашивают его по Граму и микроскопируют. После установления чистоты выделенной культуры приступают к идентификации вида стрептококка.