ВЕКТОРНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК. ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ ПЛАЗМИД БАКТЕРИЙ

В начале 50-х гг. XX в. было установлено, что типы спаривания клеток бактерий обусловлены генетически и что генетическая инфор­мация переносится из клеток мужского типа в клетки женского типа, или реципиеитпые клетки. Их способность служить донорами пере­давалась при конъюгации чаще, чем любой другой генетический при­знак. Она получила название «F-фактор», или фактор фертильности (плодовитости). Он напоминал виехромосомиые генетические эле­менты, имеющиеся в цитоплазме высших организмов, и в 1952 г. Ле-дерберг присвоил подобным системам общее название — плазмиды. Итак, плазмиды — это автономные самореплицирующиеся генетиче­ские единицы (ДНК-содержащие), найденные у бактерий, грибов, рас­тений и животных. Возможность их использования как векторов для введения чужеродных генов в бактериальные клетки начиная с 1975 г. послужила толчком для стремительного развития исследований в области генетической инженерии. На основе плазмидных векторов к настоящему времени сконструировано и клонировано большое разно­образие рекомбинантных ДНК, содержащих гены различных орга­низмов — от самых примитивных до человека. Наибольшее примене­ние в генетической инженерии нашли бактериальные плазмиды, осо­бенно образованные Е. coli. Так, последняя дает ColEl, ColEl Amp (несет геи устойчивости к ампициллину), pBR322 (несет гены устой­чивости к ампициллину и тетрациклину), pBR325 (песет гены устой­чивости к ампициллину, тетрациклину, хлорамфеииколу), pUC-плаз-миды (несут гены устойчивости к ампициллину, дефектны по гену (З-галактозидазы); из Bacillus subtilis получается pUBHO (несет ген устойчивости к канамицину); из дрожжей — pYAC (для клонирова­ния больших фрагментов ДНК — 50 — 100 к Да в длину); из Agro-bacterium tumefaciens — Ti-плазмиды: pTi-B6-806 (несет геи, кодиру­ющий октопин) и pTi-C58 (несет ген, кодирующий иопалии), которые используются в генетической инженерии растений.

Рассмотрим подробнее строение одной из этих плазмид, а именно плазмиды pBR322 (рис. 3), которая была сконструирована в лабора­тории Бойера.

Эта плазмида несет два селективных маркера, определяющих устойчивость к тетрациклину и ампициллину. Наиболее часто она используется для клонирования Pstl-фрагментов, хотя возможно ее применение для клонирования и других рестриктов.

Плазмиды pBR322 и ColEl могут реплицироваться в Е. coli и близких видах Enterobacteriaceae. В бактериальных клетках они представлены несколькими копиями: так, для ColEl число плазмид­ных копий на хромосому равно примерно 20, а для pBR322 — 40. Это обстоятельство очень важно для клонирования. Чем больше число копий клонированного гена, тем выше выход кодируемого белка. 24


Кроме того, многокопийные плазмиды не так легко утрачиваются при культивировании. С другой стороны, малое число копий плазмиды иногда имеет свои преимущества, например, при клонировании таких генов, продукты которых в большом количестве гибельны для бакте­риальной клетки.

PSC101 ТпЗ I Clal

Р и с. 3. Схема строения плазмиды pBR322

Начало репликации ColEl и pBR322 контролируется небольши­ми молекулами РНК, которые взаимодействуют с особым участком плазмиды, расположенным поблизости от точки инициации реплика­ции. Далее она идет в одном направлении и заканчивается вблизи этой точки. Генетики, стремящиеся максимально увеличить выход бел­ков, кодируемых клонированными в pBR322 генами, получали мутан­ты с модифицированными РНК. У некоторых из них число копий плазмиды составляет более 100, что приводит к существенному увели­чению выхода продуктов, кодируемых клонированными генами. Инте­ресная особенность репликации ColEl и pBR322 заключается в том, что она полностью обеспечивается ферментами хозяина. Сами плаз­миды не несут информации, нужной для кодирования ферментов реп­ликации. Процессы репликации pBR322 и ColEl, с одной стороны, и хромосомы Е. coli — с другой, различаются тем, что первый не подав­ляется хлорамфениколом, который блокирует синтез белка. Поэтому при выделении плазмид pBR322 для увеличения выхода плазмидной


ДНК к культуре за несколько часов до сбора клеток иногда добав­ляют хлорамфеиикол.

Инициация репликации R1 кишечной палочки регулируется бел-ком-репрессором, кодируемым одним из генов этой плазмиды.

Небольшой сегмент R1, содержащий участок начала репликации и связанные с ним регулирующие элементы, был использован для создания плазмид-векторов, применяемых при клонировании разно­образных генов. Преимущество таких векторов заключается в том, что при повышенной температуре с их помощью можно получить множество копий клонируемого гена, а следовательно, и много белка, кодируемого им.

При конструировании векторов на основе плазмид обычно учи­тываются три условия:

1) плазмида должна иметь ограниченное количество участков узна­вания одной рестриктазой, под действием которой кольцевая молеку­ла превращается в линейную. По границам данного разрыва проис­ходит встраивание чужеродного сегмента ДНК. Чем больше плазми­да содержит уникальных участков узнавания для различных рест-риктаз, тем она универсальнее, т. е. допускает встраивать фрагменты, полученные рестриктазами различной специфичности;

2) вновь сконструированная рекомбинантная кольцевая ДНК должна сохранить репликативные свойства исходной плазмиды;

3) вектор должен иметь генетический маркер, позволяющий ве­сти отбор рекомбинантных клонов.

В принципе методика клонирования в плазмидных векторах очень проста. ДНК плазмиды расщепляют рестриктирующей эндонуклеа-зой и соединяют in vitro с чужеродной ДНК. Затем получающими­ся рекомбииантиыми плазмидами трансформируют бактерии. Часто используют метод инактивации в результате вставки для тех плазмид, которые содержат несколько маркеров устойчивости к антибиотикам. Очищенную плазмидную ДНК и ту, которая должна быть встроена, расщепляют таким рестриктирующим ферментом, который узнает в плазмиде уникальный сайт, расположенный внутри гена устойчиво­сти, например, к тетрациклину. Проводят лигирование этих двух ДНК в соответствующих концентрациях и лигированной смесью трансфор­мируют, например, чувствительные к ампициллину клетки Е, coli так, что они становятся устойчивыми к этому антибиотику.

ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ ФАГА Я

Фаг X — умеренный фаг, паразитирующий на клетках Е. coli, содержащий ДНК. Размер последней составляет 45 тыс. пар нукле-отидов, включающих три группы генов и срединную область, которая несет информацию о белке-репрессоре, а также участок для встраи­вания ДНК фага в ДНК бактерии. По обе стороны от срединной


области располагаются предранние гены, за ними — задержаинорап-ние, далее — поздние гены, заканчивающиеся двумя cos-участками. Функция первых — поддержание лизогенного состояния бактерио­фага в клетке. Поздние гены синтезируют фаговые белки, лизирую-щие клетки и способствующие выходу из бактериальной клетки. Не­посредственно cos-участки отвечают за упаковку фаговой ДНК в бел­ки. При конструировании векторов на основе фага X чаще всего используют метод замещения. В этом случае вырезают срединный фрагмент при помощи рестриктаз. На его месте пришивается реком-бинантная ДНК размером до 24 000 пар нуклеотидов, которую потом упаковывают в фаговые белки и используют для трансформации кле­ток.

КОСМИДЫ. ФАЗМИДЫ

В 1978 г. был описан новый вид векторных молекул, получивших название «коемиды». Это гибридные векторы, в состав которых вхо­дят три компонента: участок плазмиды, включающий ген устойчиво­сти к антибиотику и ориджин; cos-участок фага X; рекомбинантная ДНК. Наличие в составе космид cos-участка позволяет производить упаковку ДНК в головку фага и использовать механизмы последнего для трансформации клеток. Емкость космидных векторов - от 33 до 49 тыс. пар нуклеотидов. Фазмидами называют гибриды фагов и плазмид, способные развиваться и как первые, и как вторые. Фазми-ды создаются на основе фага Р1. В отличие от космид они обладают меньшей емкостью, однако позволяют использовать методы ДНК-ана­лиза, не перенося информацию из фаговых векторов в плазмидные.