Конструирование штамма-суперпродуцента L-треонина
на базе штамма Е. сой К12
В течение 1977 — 1980 гг. во ВНИИ генетики на базе лабораторного штамма Е. coli K12 сконструирован штамм-продуцент L -треонина — незаменимой аминокислоты, используемой в медицине и сельском хозяйстве.
L-треонин образуется из аспарагиновой кислоты. Кроме того, из нее синтезируются лизин, метионин, изолейцин — так называемое 32
аспарагиновое семейство аминокислот. В биосинтезе треонина принимают участие четыре фермента, три из которых контролируются генами треоиинового оперона. Ген thrA ответствен за синтез полипептида, обладающего двумя ферментативными активностями: аспар-токиназиой и гомосериндегидрогеназной. Ген thrB кодирует гомосе-ринкиназу, a thrC — треоиинсинтетазу.
Регуляция активности оперона осуществляется посредством муль-тивалентной репрессии (треонин + изолейцин). Кроме того, первый фермент цепи (аспартокиназа-гомосериидегидрогеиаза) ингибирует-ся треонином.
Для сверхпродукции треонина следует прежде всего преодолеть барьеры негативной регуляции избытком этой аминокислоты. Обычный путь селекции заключается в мутагенезе и отборе штаммов, устойчивых к структурному аналогу основного продукта.
В данном случае использовалась селекция по устойчивости к (3-оксинорвалину. Это вещество заменяет треонин при взаимодействии с аллостерическим центром ферментного комплекса аспартокиназы-гомосериидегидрогеназы. Естественно, что клетки становятся в таких условиях ауксотрофными по треонину и изолейцину и гибнут при росте на бедной среде. Выживают лишь те, у которых сняты барьеры негативной регуляции. Среди последних были отобраны две ценные мутации: 1) в гене thrA, делающая продукт этого гена нечувствительным к избытку треонина; 2) с частичным блоком на пути от треонина к изолейцину. Вследствие мультивалентного характера репрессии недостаток изолейцина в клетке может привести к дерепрессии оперона.
Вышеперечисленные манипуляции привели к получению штамма-продуцента L-треонина, способного синтезировать 2 — 3 г/л этой аминокислоты.
Далее была предпринята попытка усилить сверхпродукцию треонина, увеличив число копий мутантного треоиинового оперона в клетке Е. coli путем его клонирования в составе многокопийной гибрид-ной плазмиды рВР322. Трансформированная в Е. coli K12, она суще-ствовала в микроорганизме стабильно (20 копий в клетке). Приблизительно во столько же раз в клетке увеличилось и число ферментов, кодируемых треониновым опероном. Количество треонина, синтезируемого такими клетками Е. coli, достигало 20 — 30 г/л. Это в два-три раза превышало лучшие мировые достижения 80-х гг. XX в.
Но на этом работа по совершенствованию штамма не прекратилась, поскольку он обладал двумя существенными недостатками. Полученный продуцент, как и родительский штамм Е. coli K12, рос на средах с глюкозой или фруктозой. Клеткам не хватало фермента, расщепляющего сахарозу. Следовательно, штамм не мог развиваться на этом дешевом и доступном субстрате. Методом конъюгации недо-
стающий ген (гены), ответственный за утилизацию сахарозы, был внесен в штамм-продуцент из родственного вида энтеробактерий.
Вопрос о стабилизации полученного штамма был решен следующим способом. Среди мутаций была выбрана одна, способная обеспечивать бактерию необходимым для роста количеством изолейцииа при условии, что клетка производит треонин в очень больших количествах. Если по каким-либо причинам данное условие не соблюдается (потеря плазмиды, структурная перестройка плазмиды), то биосинтез нужного количества изолейцииа становится невозможным. Клетка погибает.
Дальнейшая селекция, оптимизация условий ферментации привели к созданию рекордного процесса биосинтеза L-треонина, при котором за 30 — 40 ч ферментации накапливается до 55 г/л аминокислоты с конверсией по сахару, превышающей 40 %.