Конструирование штамма-суперпродуцента L-треонина

на базе штамма Е. сой К12

В течение 1977 — 1980 гг. во ВНИИ генетики на базе лабора­торного штамма Е. coli K12 сконструирован штамм-продуцент L -тре­онина — незаменимой аминокислоты, используемой в медицине и сель­ском хозяйстве.

L-треонин образуется из аспарагиновой кислоты. Кроме того, из нее синтезируются лизин, метионин, изолейцин — так называемое 32


аспарагиновое семейство аминокислот. В биосинтезе треонина при­нимают участие четыре фермента, три из которых контролируются генами треоиинового оперона. Ген thrA ответствен за синтез поли­пептида, обладающего двумя ферментативными активностями: аспар-токиназиой и гомосериндегидрогеназной. Ген thrB кодирует гомосе-ринкиназу, a thrC — треоиинсинтетазу.

Регуляция активности оперона осуществляется посредством муль-тивалентной репрессии (треонин + изолейцин). Кроме того, первый фермент цепи (аспартокиназа-гомосериидегидрогеиаза) ингибирует-ся треонином.

Для сверхпродукции треонина следует прежде всего преодолеть барьеры негативной регуляции избытком этой аминокислоты. Обыч­ный путь селекции заключается в мутагенезе и отборе штаммов, устойчивых к структурному аналогу основного продукта.

В данном случае использовалась селекция по устойчивости к (3-оксинорвалину. Это вещество заменяет треонин при взаимодействии с аллостерическим центром ферментного комплекса аспартокиназы-гомосериидегидрогеназы. Естественно, что клетки становятся в таких условиях ауксотрофными по треонину и изолейцину и гибнут при росте на бедной среде. Выживают лишь те, у которых сняты барьеры негативной регуляции. Среди последних были отобраны две ценные мутации: 1) в гене thrA, делающая продукт этого гена нечувствитель­ным к избытку треонина; 2) с частичным блоком на пути от треонина к изолейцину. Вследствие мультивалентного характера репрессии не­достаток изолейцина в клетке может привести к дерепрессии оперо­на.

Вышеперечисленные манипуляции привели к получению штам­ма-продуцента L-треонина, способного синтезировать 2 — 3 г/л этой аминокислоты.

Далее была предпринята попытка усилить сверхпродукцию трео­нина, увеличив число копий мутантного треоиинового оперона в клет­ке Е. coli путем его клонирования в составе многокопийной гибрид-ной плазмиды рВР322. Трансформированная в Е. coli K12, она суще-ствовала в микроорганизме стабильно (20 копий в клетке). Прибли­зительно во столько же раз в клетке увеличилось и число ферментов, кодируемых треониновым опероном. Количество треонина, синте­зируемого такими клетками Е. coli, достигало 20 — 30 г/л. Это в два-три раза превышало лучшие мировые достижения 80-х гг. XX в.

Но на этом работа по совершенствованию штамма не прекратилась, поскольку он обладал двумя существенными недостатками. Полу­ченный продуцент, как и родительский штамм Е. coli K12, рос на средах с глюкозой или фруктозой. Клеткам не хватало фермента, расщепляющего сахарозу. Следовательно, штамм не мог развиваться на этом дешевом и доступном субстрате. Методом конъюгации недо-


стающий ген (гены), ответственный за утилизацию сахарозы, был внесен в штамм-продуцент из родственного вида энтеробактерий.

Вопрос о стабилизации полученного штамма был решен следующим способом. Среди мутаций была выбрана одна, способная обеспечи­вать бактерию необходимым для роста количеством изолейцииа при условии, что клетка производит треонин в очень больших количествах. Если по каким-либо причинам данное условие не соблюдается (поте­ря плазмиды, структурная перестройка плазмиды), то биосинтез нуж­ного количества изолейцииа становится невозможным. Клетка поги­бает.

Дальнейшая селекция, оптимизация условий ферментации приве­ли к созданию рекордного процесса биосинтеза L-треонина, при кото­ром за 30 — 40 ч ферментации накапливается до 55 г/л аминокис­лоты с конверсией по сахару, превышающей 40 %.