Окраска по Граму
Принцип. В зависимости от химической структуры бактерии обладают способностью удерживать краситель кристаллический фиолетовый или обесцвечиваться в спирте.
Реактивы.
1. Карболовый раствор кристаллического фиолетового. Растирают в ступке 1 г кристаллического фиолетового с 2 г фенола (карболовой кислоты) до кашицеобразной консистенции, прибавляют небольшими порциями 10 мл спирта и окончательно разводят 100 мл дистиллированной воды, сливают во флаконы, оставляют на сутки, затем фильтруют.
2. Раствор Люголя: йодистого калия 2 г растворяют в 300 мл дистиллированной воды, в полученном растворе растворяют 1 г кристаллического йода, фильтруют через бумажный фильтр.
3. Разведенный фуксин Циля. Растирают в ступке 1 г фуксина, прибавляют, растирая, 5 г фенола (карболовой кислоты) и 10 мл спирта 96%, затем при постоянном помешивании небольшими порциями доливают 100 мл дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин Циля очень стойкий и может храниться долгое время во флаконе темного стекла с притертой пробкой. К 1 мл фуксина Циля добавляют 9 мл дистиллированной воды. Раствор очень нестойкий, поэтому его готовят непосредственно перед употреблением в необходимых количествах.
Ход исследования. На обезжиренное стекло наносят каплю воды, в которой суспендируют культуру. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем горелки. На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор кристаллического фиолетового на 1/2-1 мин. Сливают краситель и, не смывая, наливают раствор Люголя приблизительно на 1 мин. до почернения мазка. Сливают раствор Люголя и прополаскивают препарат в спирте 96% в течение 1/2-1 мин., пока не перестанут стекать фиолетовые струйки красителя. Затем препарат промывают струей водопроводной воды и дополнительно докрашивают в течение 1/2-1 мин. водным раствором фуксина Циля. Краситель сливают, препарат промывают и высушивают.
Микроскопируют с иммерсией: объектив х90 иммерсионный, окуляр х7 или х10. Грамположительные микробы окрашиваются в сине - фиолетовый цвет, грамотрицательные - в розовый и красный.
При правильной окраске препарат оранжево - красного цвета на тонких участках, лилово - фиолетового на толстых. Высокое качество окраски обеспечивается своевременным прекращением обесцвечивания мазков. При недообесцвечивании мазков грамотрицательные бактерии могут сохранять фиолетовую окраску, а в переобесцвеченных мазках грамположительные микробы могут быть окрашены в оранжево - красный цвет.