Применение иммобилизованных биокатализаторов
В медицине
В настоящие время природные физиологически активные вещества (ФАВ) белковой природы, в первую очередь ферменты, рассматривают как перспективное средство медикаментозного лечения вследствие их чрезвычайно высокой активности и специфичности. Однако некоторые недостатки ферментов препятствуют их действительно широкому применению в практической медицине. Это мобильность в физиологических условиях, быстрое выведение из организма и разрушение под действием эндогенных протеаз, антигенность как чужеродных организму белков; нередко — токсичность и малая доступность, высокая стоимость. Анализ сложившегося положения привел ученых к выводу, что эти недочеты в большинстве случаев можно устранить, если использовать в практической медицине не нативные ферменты, а их иммобилизованные производные.
Иммобилизация белковых лекарственных препаратов проводится на носителях, которые сами по себе не должны создавать осложнения и способствуют проникновению фермента к желаемой цели. Конечно,
применяемый полимер и сшивающий агент должны быть нетоксичными, кроме того, следует исключить возможность повышения токсичности при биодеградации коньюгата. А если фермент иммобилизуется на нерастворимом носителе с острыми углами, он не должен деформировать форменные элементы биологических жидкостей.
Лекарственные вещества белкового или пептидного происхождения, иммобилизованные на соответствующем носителе, представляют собой структуру, модель которой представлена на рис. 31, откуда следует, что возможны значительные ее вариации. Например, если полимер растворим, то не требуется солюбилизирующего агента. Если лекарство заключено в полимерную оболочку (капсулу) и действует на проникающий внутрь капсулы субстрат или катализирует превращение внешнего субстрата при постепенной деградации оболочки, то не требуется химического связывания.
|
|
| Полимерная цепь |
Стабилизация
Биодеградация
|
Освобождение
лекарства путем
расщепления связи
Специфический вектор
Неспецифический агент
Рис. 31. Модель структуры лекарственного препарата
Желаемые свойства (растворимость, нетоксичность, специфичность) могут быть достигнуты при связывании белка с полимерной целью, которая в свою очередь модифицируется определенным способом. К примеру, известно, что высокомолекулярное соединение само по себе не может проникнуть внутрь клетки путем диффузии, но попадает в нее путем эндоцитоза, если для этого полимер снабжен химическими группами, специфично взаимодействующими с клеточной мембраной.
Вообще нужно стремиться к созданию препаратов, в которых отмечалось бы высокое содержание лекарства по отношению к количеству носителя. Из-за примерной одиопорядковости молекулярной массы на одной молекуле растворимого полимера часто оказывается не более одной молекулы белка, часть первого сопровождает лекарственный препарат как балласт. Если полимер содержит заряженные группы, можно ожидать хорошего связывания, поскольку образуются ие-ковалентные комплексы, разделить которые удается только при высокой ионной силе раствора. Они могут вести себя как «депо» лекарственного средства, находящегося в иативиом состоянии.
Препараты ферментов повышенной молекулярной массы могут быть изготовлены путем немолекулярного сшивания бифункциональными реагентами. Такие соединения стабильны в физиологических условиях, большая молекулярная масса исключает немедленное их выведение почками.
Перспективными направлениями лечения ряда заболеваний являются методы, основанные па гемосорбции и лимфосорбции, которые строятся на пропускании крови через колонку, заполненную соответствующим носителем с иммобилизованным ферментом или без него. Эти носители содержат специфические соединения, способные связывать токсины, находящиеся в организме. Иногда удобнее применять твердые их виды, содержащие ферменты. Основное требование к ним — они не должны вызывать деформацию форменных элементов крови. Модификация таких носителей (стекло, керамика, силикаты) с целью введения в них групп, связывающих белки, проводится методами, способствующими вступлению в реакции с ОН-группами носителей. Исходный материал для матрицы должен выбираться таким, чтобы наблюдалась минимальная специфическая сорбция.
К медицинским препаратам, иммобилизованным на твердых носителях, можно отнести также перевязочные материалы, содержащие обычно протеолитические ферменты, которые применяются для очищения гнойных ран.
Лекарственные вещества, в которых соотношение белок / полимер по массе очень высокое и достигает сотен тысяч и выше, могут быть изготовлены с помощью метода «искусственной клетки» и липосом. Они представляют собой микросферы с проницаемой оболочкой.
Первым типом искусственных клеток являются микрокапсулы, представляющие собой крошечные реакторы диаметром от 103 до 5 х х 104 нм, тонкая оболочка которых (200 — 400 нм) проницаема для низкомолекулярных соединений..Фермент, находящийся внутри оболочки, не контактирует с жидкостями и тканями организма, не разрушается протеииазами, не ингибируется, не вызывает иммунного ответа. Основное достоинство микрокапсул заключается в том, что их можно имплантировать в нужное место для переработки метаболитов, способствующих росту опухолевой ткани.
Микрокапсулы с белковым содержимым готовятся следующим
образом. Создается микроэмульсия водного раствора вещества в органическом растворителе. Полимерный материал растворен во внешней фазе, к которой добавляют вещества, способствующие его осаждению на капле эмульсии. Растворы содержат также мономеры, полимеризу-ющиеся на границе раздела фаз. Однако следует учесть, что в этом случае существуют диффузионные ограничения. Фермент может быть предварительно стабилизирован перед включением в капсулы. Иногда последние могут содержать микроскопические участки тканей. Например, есть экспериментальные данные по созданию «депо» инсулина путем имплантации микрокапсул, содержащих островки Лангер-гаиса, синтезирующие в поджелудочной железе инсулин.
Полимерная стенка обычно изготавливается из прочных полимеров. Следует учитывать, что микрокапсулы, вводимые в кровь, могут забивать кровеносные сосуды и, следовательно, являться причиной образования тромбов. Однако эффективность при использовании их в виде колонок для диализа в аппарате типа «искусственная почка» несомненна. При этом объем аппаратов и количество необходимых и очень дорогих растворов резко сокращается.
Сейчас интенсивно исследуются свойства микрокапсул, стенки которых состоят из оболочек эритроцитов. Без содержимого они называются «тенью». Стенку заполняют ферментом. Достоинство в этом случае заключается в том, что носитель совместим с организмом пациента.
Проблему введения лекарственных препаратов в клетки можно решить созданием контейнеров — переносчиков типа липосом и мицелл. Оболочка может представлять собой однослойную или многослойную поверхность, образованную в свою очередь бислойной структурой, которая создается соединениями, имеющими гидрофильную группу и два достаточно длинных гидрофобных участка. Яркими представителями этих соединений являются фосфолипиды, которые содержат насыщенные углеводородные цепи и плавятся при физиологических температурах. Для каждого их типа имеется определенная температура плавления твердой структуры.
Липосомы образуются путем обработки ультразвуком водной дисперсии липидов температурой, более высокой, чем нужна для их застывания, или впрыскиванием спиртового раствора липида в водную фазу. Лекарство может быть введено внутрь липосомы, если оно гидрофильно, или в стенку, если оно гидрофобно. Диаметр липосом от 20 до 103 им, и поэтому применять их как контейнеры для доставки ферментов нецелесообразно, если нет возможности с точностью нацелить их на определенную клетку. Однако липосомы имеют и преимущества: так как их поверхность легко модифицируется, они могут адсорбироваться на клетке и поглощаться ею путем эндоцитоза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Сегодня биотехнология стремительно выдвинулась на передовые рубежи научно-технического прогресса благодаря бурному развитию молекулярной генетики и биологии, биохимии и биофизики, опирающихся в свою очередь на достижения физики, химии и вычислительной математики, что позволяет использовать потенциал живых организмов в интересах человека. С другой стороны, человечество испытывает огромную потребность в новых технологиях, способных ликвидировать нехватку продовольствия, энергетики, минеральных ресурсов, улучшить состояние здоровья людей и экологическую ситуацию. Решению этих задач может способствовать развитие новых технологий с использованием биообъектов — биотехнологии.
Целью предложенного учебного пособия является ознакомление с основными достижениями биотехнологии на сегодняшнем этапе ее развития, с главными направлениями разработок в области генетической, клеточной и белковой инженерии, а также прикладными аспектами использования данных методов. Усвоение основных приемов, используемых в биотехнологии для выведения новых сортов растений • и пород животных, для создания новых промышлеино важных продуцентов биологически активных веществ, а также в медицине, сельском хозяйстве, экологии, производстве дешевой энергии, обезвреживании отходов производств и ряд других, — основная задача представленного курса.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Биотехнология : в 8 кн. / под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. М. : Высш. шк., 1987. Кн. 1 - 8.
2. Биотехнология клеток животных : в 2 т. / под ред. Р. Е. Списра, Дж. Б. Гриф-фитса ; пер. с англ. В. М. Тарасенко ; ред. и предисл. перевода Г. А. Сафонова. М. : Мир, 1989. Т. 1. 365 с. Т. 2. 517 с.
3. Биотехнология / отв. ред. А. А. Баев. М. : Наука, 1984. 312 с.
4. Биотехнология. Принципы и применение / под ред. И. Хиггинса, Д. Бсста, Дж. Джонса. М. : Мир, 1988. 479 с.
5. Биотехнология растений: культура клеток / Г. П. Болвслл, К. Р. Вуд, Р. А. Гон-залес [и др.] ; пер. с англ. В. И. Негрука ; под ред. Р. Г. Бутснко. М. : Агропромиздат, 1989. 279 с.
6. Биотехнология сельскохозяйственных растений / пер. с англ. В. И. Негрука. М. : Агропромиздат, 1987. 301 с.
7. Будников Т. К. Биосенсоры как новый тип аналитических устройств // Сорос, образоват. журн. 1996. Jsfe 12. С. 26 — 32.
8. Введение в прикладную энзимологию / под ред. И. В. Березина, К. Мартинс-ка. М. : Изд-во МГУ, 1982. 384 с.
9. Воробьева Л. И, Промышленная микробиология : учеб. пособие / Л. И. Воробьева. М. : Изд-во МГУ, 1989. 294 с.
10. Блинов Н. П. Основы биотехнологии / Н. П. Елинов. М. : Наука, 1995. 600 с.
11. Лабораторный практикум по биотехнологии / В. В. Ревин, Д. А. Кадималисв. Саранск : Изд-во Мордов. ун-та, 2000. Ч. 1. 292 с.
12. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. М. : Мир, 1984. 479 с.
13. Промышленная микробиология / под ред. 3. А. Аркадьевой ; под общ. ред. Н. С. Егорова. М. : Высш. шк., 1987. 470 с.
14. СассонА. Биотехнология: свершения и надежды / А. Сассон. М. : Мир, 1987. 367 с.
15. Сельскохозяйственная биотехнология : учебник / В. С. Шевслуха, Е. А. Калашникова, С. В. Дегтярев [и др.] ; под ред. В. С. Шевелухи. М. : Высш. шк., 1998. 416 с.
16. Уотсон Дж. Рекомбинантныс ДНК. Краткий курс / Дж. Уотсон, Дж. Туз, Д. Курц. М. : Мир, 1986. 285 с.
17. Шеховцева Т. Н. Ферменты и их использование в химическом анализе // Сорос, образоват. журн. 2000. Т. 6, № 1. С. 44 — 48.
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................. 3
Глава 1. ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК....................................... 14
1.1. Предмет и задачи генетической инженерии.
Взаимосвязь биотехнологии и генетической инженерии............................................... 14
1.2. История возникновения и развития методов работы
с рекомбинантными ДНК.......................................................................................... 15
1.3. Молекулярное клонирование.............................................................................. 16
1.4. Способы получения нужного гена. Подстановка полученного гена
под контроль регуляторных элементов клетки-хозяина............................................... 20
1.5. Векторные молекулы ДНК. Векторы на основе плазмид бактерий............. 24
1.6. Векторы на основе фага Я................................................................................... 26
1.7. Космиды. Фазмиды............................................................................................ 27
1.8. Транспозоны и вставочные последовательности................................................... 27
1.9. Геномные библиотеки и их конструирование........................................................ 28
1.10. Идентификация клеток-реципиентов, несущих ген-мишень.................................. 29
Глава 2. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
ТЕХНОЛОГИИ рДНК....................................................................................... 32
2.1. Конструирование штаммов-суперпродуцентов первичных
и вторичных метаболитов методами генной инженерии............................................... 32
2.1.1. Конструирование штамма-суперпродуцента L-треонина
на базе штамма Е. coli K12............................................................................. 32
2.1.2. Конструирование штамма-суперпродуцента рибофлавина
(витамина В2) на базе Bacillus subtilis............................................................ 34
2.1.3. Метаболическая инженерия....................................................................... 35
2.2. Получение гормонов человека, интерферонов и интерлейкинов
генно-инженерными методами................................................................................... 36
2.2.1. Получение гормонов человека генно-инженерными методами..................... 36
2.2.2. Получение интерферонов и интерлейкинов
генно-инженерными методами............................................................................ 39
2.3. Получение «безопасных» вакцин методами генетической инженерии..................... 43
2.3.1. Вакцины. Определение, история развития методов вакцинации................... 43
2.3.2. Использование методов генной инженерии при создании «безопасных» вакцин. Поколения вакцин........................................................................................... 44
2.3.3. Вакцины против вируса гепатита В............................................................ 46
2.3.4. Вакцины против вируса гриппа................................................................. 47
2.3.5. Вакцины против вируса ящура.................................................................. 48
2.3.6. Вакцины против вируса полиомиелита....................................................... 48
2.3.7. Подходы к конструированию вакцин против ВИЧ...................................... 49
Глава 3. НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ, ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА...................................... 52
3.1. Генетическая инженерия растений........................................................................ 52
3.1.1. Задачи и проблемы генетической инженерии растений................................ 52
3.1.2. Агробактсриальные трансформирующие векторы растений....................... 53
3.1.3. Другие векторные системы, используемые в генетической
инженерии растений........................................................................................... 57
3.1.4. Методы прямого переноса чужеродной ДНК в клетках растений................ 58
3.1.5. Магистральные пути развития генетической инженерии растений................ 59
3.2. Практическое применение генетической инженерии растений................................ 60
3.2.1. Генно-инженерные работы в области биологической фиксации азота.......... 60
3.2.2. Генно-инженерные работы в области повышения
эффективности фотосинтеза................................................................................ 63
3.2.3. Генно-инженерные работы в области увеличения содержания незаменимых аминокислот...................................................................................................... 64
3.2.4. Генно-инженерные работы по созданию растений, устойчивых
к ранним заморозкам......................................................................................... 66
3.2.5. Генно-инженерные работы по созданию растений, устойчивых
к гербицидам......................................................... -........................................... 67
3.3. Генетическая инженерия сельскохозяйственных животных.................................... 69
3.3.1. Трансгенные сельскохозяйственные животные.
Принципиальные возможности генетической инженерии
в животноводстве............................................................................................ 69
3.3.2. Векторы, используемые в генетической инженерии животных
(на основе литических вирусов, ретровирусов).................................................... 71
3.3.3. Генетическая трансформация зародышей млекопитающих......................... 73
3.3.4. Генно-инженерные работы с геном гормона роста животных. Получение животных с ускоренным ростом и увеличенной массой........................................................ 74
3.3.5. Главные направления генно-инженерных работ
со структурными белками молока. Получение фармакологических
белков в молоке трансгенных животных.............................................................. 75
3.3.6. Генно-инженерное изменение качества и выхода шерсти овец..................... 76
3.4. Генетическая инженерия человека........................................................................ 77
3.4.1. Основные направления генетической инженерии человека....'....................... 77
3.4.2. Соматическая генная терапия. Векторы, используемые
для трансформации клеток человека.................................................................... 78
Глава 4. ПРОЦЕССЫ ФЕРМЕНТАЦИИ И ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУКТА
В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВАХ........................................... 85
4.1. Процессы ферментации в биотехнологических производствах............................... 85
4.2. Кинетика роста микроорганизмов в периодических и проточных процессах 87
4.3. Классификация ферментационных процессов....................................................... 89
4.4. Количественные параметры ферментационных процессов.................................... 91
4.5. Классификация биореакторов по функциям и типу...................................... 96
4.6. Принципы масштабирования в биотехнологическом производстве...................... 100
Глава 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ ПЕРВИЧНЫХ И ВТОРИЧНЫХ
МЕТАБОЛИТОВ................................................................................................. 105
5.1. Получение полисахаридов........................................................................... 105
5.1.1. Характеристика полисахаридов............................................................... 105
5.1.2. Биосинтез полисахаридов........................................................................ 109
5.1.3. Практическое применение полисахаридов................................................ 113
5.1.4. Получение микробных полисахаридов в промышленности....................... 117
5.2. Получение органических кислот из углеводов
на примере лимонной кислоты................................................................................. 122
5.2.1. История получения лимонной кислоты..................................................... 122
5.2.2. Продуценты лимонной кислоты............................................................... 123
5.2.3. Сверхсинтез лимонной кислоты............................................................... 124
5.2.4. Производство лимонной кислоты............................................................. 124
5.2.5. Механизм биосинтеза.............................................................................. 129
5.3. Производство аминокислот при помощи микроорганизмов................................ 130
5.3.1. Производство аминокислот из биосинтетических предшественников........... 133
5.4. Получение белка............................................................................................... 136
5.4.1. История использования микроорганизмов для получения белка................ 136
5.4.2. Технологический процесс выращивания микроорганизмов
(на примере кормовых дрожжей)...................................................................... 137
5.4.3. Основные виды сырья и используемые микроорганизмы.......................... 138
5.4.4. Перспективы производства белка с использованием микроорганизмов 140
5.5. Биотехнология бродильных производств........................................................... 142
5.5.1.Спиртовое брожение............................................................................... 142
5.5.2.Пропионово-кислое брожение.................................................................. 152
5.5.3. Ацетонобутиловое брожение.................................................................... 154
Глава 6. НЕКОТОРЫЕ СПЕЦИФИЧЕСКИЕ НАПРАВЛЕНИЯ
БИОТЕХНОЛОГИИ............................................................................................ 160
6.1. Белковая инженерия.......................................................................................... 160
6.1.1. Белковая инженерия. Создание новых белков.
Молекулярная эволюция. Химическая модификация белков..................... 160
6.1.2. Сайт-направленный мутагенез как метод введения
в белковую молекулу отдельных аминокислотных замен.
Его применение к ферментам............................................................................ 161
6.2. Клеточная инженерия животных. Гибридомная технология................................. 162
6.2.1. История создания метода гибридом......................................................... 162
6.2.2. Получение моноклональных антител........................................................ 164
6.2.3. Практическое применение моноклональных антител................................. 165
6.3. Сельскохозяйственная биотехнология................................................................ 169
6.3.1. Получение биопрепаратов для защиты растений....................................... 169
6.3.2. Создание бактериальных препаратов для защиты растений.
Работы по введению гена 6-эндотоксина в геном растений................................... 170
6.3.3. Технология получения грибных энтомопатогенных препаратов................ 172
6.3.4. Технология получения вирусных энтомопатогенных препаратов............... 175
6.3.5. Неспецифические методы защиты растений.
Иммунизация растений..................................................................................... 177
6.4. Получение биологических удобрений................................................................ 177
6.4.1. Получение ризоторфина (нитрагина)........................................................ 178
6.4.2. Получение азотобактерина....................................................................... 180
6.4.3. Получение фосфоробактерина................................................................. 182
6.5. Техническая биоэнергетика........................................................................184
6.5.1. Получение биогаза биотехнологическими методами..............................184
6.5.2. Получение низкомолекулярных спиртов.............................................188
6.5.3. Получение тепловой энергии при бактериальном окислении.................190
6.5.4. Получение молекулярного водорода......................................................191
6.5.5. Биотопливные элементы...................................................................192
6.6. Биогсотсхнология металлов........................................................................193
6.6.1. Бактериальное выщелачивание металлов.............................................193
6.6.2. Микробиологическое извлечение металлов из растворов.........................196
6.7. Биотехнология и экология............................................................................198
6.7.1. Природа и количество отходов и побочных продуктов биотсхнологической промышленности............................................................198
6.7.2. Микробная деградация и конверсия отходов в кормовые продукты, энергетическое сырье, удобрения, технический белок, липиды.........................199
6.7.3. Подходы к решению проблемы очистки водоемов
от разливов нефти и различных углеводородов.......................................202
6.8. Инженерная энзимология............................................................................204
6.8.1. Носители для иммобилизации ферментов и клеток.................................204
6.8.2. Методы иммобилизации ферментов....................................................208
6.8.3. Применение иммобилизованных ферментов в промышленности.............224
6.8.4. Применение иммобилизованных ферментов в микроанализе. Биосенсоры...............................................................................................239
6.8.5. Применение иммобилизованных биокатализаторов в медицине..............247
ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................251
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
6.4.1. 252