РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ
ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Цитохромоксидаза является хромопротеином, содержит геминовую группу и Cu2+, активна в растительных и животных тканях, осуществляет перенос электронов на кислород в цепи тканевого дыхания. Определение активности фермента дает представление о функционировании цепи переноса электронов.
ПРИНЦИП МЕТОДА. Смесь a-нафтола и п-фенилендиамина (реактив «НАДИ») окисляется цитохромоксидазой в присутствии кислорода, образуя продукт конденсации индофеноловый синий по схеме:
ХОД РАБОТЫ:
А. Получение ферментного препарата.
0,5 г свежих мышц растирают в ступке с 10 мл Н2О. Воду сливают, мышечную ткань просушивают фильтровальной бумагой.
Б. Определение активности фермента.
Мышечную ткань разделяют на 2 части. Одну помещают на фильтр, другую переносят в пробирку, добавляют 1 мл Н2О и кипятят 1 минуту. После охлаждения извлекают прокипяченную мышечную ткань стеклянной палочкой и помещают на фильтр.
На обе порции мышц наносят по 2 капли реактива «НАДИ» (смесь п-фенилендиамина и a-нафтола). Инкубация 5-10 минут, при температуре 18оС (комнатная).
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
Дата: _______________
ЗАНЯТИЕ № 13
РАБОТА № 1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКРОЭРГИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ МЫШЦ
ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Главный макроэрг клеток человека и животных – АТФ – образуется в реакциях окислительного и субстратного фосфорилирования АДФ. В мышцах содержится креатинфосфат – макроэрг, образующийся с участием АТФ. Оба вещества обеспечивают энергией мышцы при их сокращении.
ПРИНЦИП МЕТОДА. Богатые энергией два остатка фосфорной кислоты АТФ и фосфорный остаток креатинфосфата быстро отщепляются при гидролизе в кислой среде (лабильно связанный фосфор). Сравнение содержания неорганического фосфора, определяемого по цветной реакции с молибдатом аммония и аскорбиновой кислотой до и после гидролиза, указывает на количество лабильно связанного фосфора макроэргов, что отражает количество макроэргических соединений в мышцах.
ХОД РАБОТЫ:
А. Выделение макроэргов из мышц.
0,5 г мышцы гомогенизируют в 5 мл охлажденной 2,5 % ТХУ во льду. Фильтруют в мерную пробирку, осадок на фильтре промывают 5 мл холодной Н2О. Объем доводят до 10 мл.
Б. Определение лабильно связанного фосфора.
Взять две пробирки: контроль и опыт.
| ОТМЕРИТЬ | КОНТРОЛЬ | ОПЫТ |
| Безбелковый фильтрат НСl, 1 М NaOH, 1 M H2O Молибдат аммония, 1 % Аскорбиновая кислота, 1 % | 0,5 мл 1 мл 1 мл 2,5 мл 0,5 мл 0,5 мл | 0,5 мл 1 мл Кипятить 10 минут, охладить 1 мл 2,5 мл 0,5 мл 0,5 мл |
| ¯ Перемешать, инкубация 10 минут, при 18оС. ¯ Колориметрия, λ = 640 нм, d = 1 cм, против контроля |
РЕЗУЛЬТАТ:
Еоп =
Расчеты:
зная Еоп, найти концентрацию фосфора в пробе по калибровочному графику (А). Конечный результат рассчитать по формуле:
содержание макроэргов в мг АТФ/ г ткани = А × 3,3 × 40.
Найти количество АТФ в 1 г мышечной ткани:
количество АТФ = масса АТФ (в граммах)/молекулярная масса АТФ
ВЫВОД:
Содержание АТФ в мышцах: » 5 мкмоль АТФ в 1 г мышечной ткани в состоянии покоя (молекулярная масса АТФ равна 507,2 г/моль).
Дата________________
ЗАНЯТИЕ № 14